GuruHealthInfo.com

Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.

zdravotnícka legislatíva


Moskva, Federal Center Štátny zdravotný a epidemiologický Ministerstvo zdravotníctva 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 04. 2000 godaData 07. 2000 vvedeniya1 goda2.3.2. Potraviny a potraviny DOBAVKIMEDIKO - Biologické hodnotenie potravinárskych výrobkov pochádzajúcich z geneticky MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Vyvinutý v Ústave výživy (Tutelian VA hlave-, Aksyuk IN, Vasilyev AV, Vorobyeva LS, VysotskiyV.G., Volgarev MN, Korolev AA, Kravchenko L . .V, Maganova NB, Mazo VK, Pokrovskaya GR, Sokol'nikov AA, Sorokin EY, TyshkoN.V.) - očkovacie látky a sera Institute. II Mechnikova Medical Sciences (Semenov BF, Britsina MV, Zakharova NS.) - (. GG Onishchenko, Petukhova AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Department of sanitárne inšpekcia) - Moscow lekárska akadémia. IM SechenovaMinzdrava Rusko (sudy NP, Suchanov bp.) - Stredisko"bioinžinierstva" RAS (Skryabin KG, Kuznetsov BB, Dorokhov DB, Asadova UE.) - Medical - Genetická centrum RAMS (Shishkin SS.) - Moscow State University of Applied biotehnologiiMinisterstva všeobecného a odborného vzdelávania RossiyskoyFederatsii (Rogov IA, riedka NG Gurov N., uzlov VV.). 2. Schválené 20.apríla 2000, prijalo Glavnymgosudarstvennym sanitárne lekár Ruskej federácie z 1. júla 2000g.3. Vpervye.1 predstavený. Všeobecné ustanovenia a rozsah pôsobnosti primeneniya1.1. Metodické pokyny stanovené trebovaniyakprovedeniyu lekársky - biologické štúdie potravinárskych výrobkov pochádzajúcich z geneticky modifikovaného istochnikov.1.2. Pokyny sú určené k uchrezhdeniysanitarno - epidemiologická služba Ruskej federácie, ktorý vykonáva štátny sanitárne - epidemiologicheskiynadzor, rovnako ako ďalšie inštitúcie akreditované naprovedenie práce v tejto oblasti.1.3. Požiadavky tohto metodického ukazaniyahv pre výrobky pochádzajúce z geneticky modifitsirovannyhistochnikov aplikovať vo fáze výroby, hygienické vyšetrenie, štátnu registráciu, verejné obstarávanie, dovoz do krajiny a realizatsii.1.4. Metodické pokyny sú navrhnuté tak, aby obespecheniyaedinogo, vedu - založený prístup k posudzovaniu kvality ibezopasnosti potravinárskych výrobkov pochádzajúcich z geneticheskimodifitsirovannyh zdrojov, vývojových štádií, preskúmanie registrácia igosudarstvennoy produktsii.1.5. Výrobca nových potravinárskych výrobkov odvodených izgeneticheski modifikované zdroje určené dlyarealizatsii na území Ruskej federácie, by mala vydať eemarkirovannoy v súlade so zavedenou poryadkom.2. Normatívne ssylki2.1. federálny zákon "Na sanitárne - epidemiologicheskomblagopoluchii populácie" z 30. marca 1999 D.2.2. "Základy legislatívy Ruskej federácie na občanov ohranezdorovya" z 22. júla 1993 g.2.3. federálny zákon "Ao zmene a doplnení Ruskej federácie vZakon "Ochrana spotrebiteľa" a KodeksRSFSR o správnych deliktoch" 9. januára 1996 D.2.4. Nariadenie o štátnej hygienickej a epidemiologické reguláciu, ktorá bola schválená Ruskej federácie PostanovleniemPravitelstva dňa 5. júna 1994 N 625.2.5. Predpisy o štátnej hygienickej a epidemiologické služby Ruskej federácie, utverzhdennoePostanovleniem ruská vláda 30. júla 1998. N 680.2.6. Rozlíšenie šéf Štátny zdravotný vrachaRossiyskoy federácie N 7 od 6. 04. 1999 "O vyhodnocovanie a evidencia výroby potravín poryadkegigienicheskoy, poluchennoyiz geneticky modifikované zdroje"0,3. Podmienky a produkty opredeleniyaPischevaya - potravinárske suroviny, potraviny produktyi komponenty.Prodovolstvennoe svoje suroviny - predmety biologického, organického a anorganického pôvodu použité dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy potravinárskych výrobkov -produktzhivotnogo, zeleniny, minerálne alebo biosyntetického pôvodu, prednaznachennyydlya ľudskú spotrebu, a to ako v objeme a vpererabotannom vide.Komponent - živočíšne látky, rastlinné, mikrobiálne ilimineralnogo pôvodu a p rirodnye sintezirovannyepischevye alebo aditíva používané na prípravu alebo proizvodstvepischevogo produktu alebo sú prítomné v konečnom produkte iskhodnomili vide.Kachestvo modifikované potraviny - súbor vlastností, ktoré určujú spotrebiteľské vlastnosti, kvality potravín ibezopasnost produktsii.Bezopasnost potravín - neexistuje nebezpečenstvo dlyazhizni a zdravie prítomné a budúce pokoleniy.Gennaya inžinierstvo - časť molekulárnej genetiky spojená tvorba stselenapravlennym v vit0ro novom com Inácio geneticheskogomateriala (rekombinantnej DNA) schopné reprodukovať buniek ifunktsionirovaniyu - hozyaine.Geneticheski modifikovaný organizmus - neskolkoorganizmov alebo organizmus, akýkoľvek nebunkové, jednobunková alebo mnogokletochnyeobrazovaniya schopný kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo genetický materiál odlišný od prirodnyhorganizmov získané s použitím metód genetického inžinierstva isoderzhaschie genetické - inžinierstvo materiál, vrátane gény, ich fragmentov alebo kombinácie genov.4. Postup pre hygienickú registráciu ekspertizyi štátnej potravinárskych výrobkov pochádzajúcich z geneticky modifitsirovannyhistochnikov4.1. Všetky potravinárske výrobky pochádzajúce zo zdrojov geneticheskimodifitsirovannyh prechádza hygienické vyšetrenie poryadke.4.2 V súčasnej dobe nainštalovaný. Vykonávací hygienické vyšetrenie gosudarstvennoyregistratsii a potravinárske výrobky pripravené z geneticheskimodifitsirovannyh zdrojov sa vykonáva podľa sporyadkom, Ruská federácia nastaviť rozlíšenie Hlavný gosudarstvennogosanitarnogo lekára od 7 06/04/99 N "O vyhodnocovanie a evidencia výroby potravín poryadkegigienicheskoy, poluchennoyiz geneticky modifikované zdroje".4.3. Organizácie, spoločnosti sú v centre sanitárne-epidemiologické normalizácie, hygienickú certifikáciu iekspertizy Ministerstva zdravotníctva dokumenty a materiály ruský Federatsiikomplekt, vrátane: - žiadosti (list) vykonávať hygienickú registráciu posúdenie igosudarstvennoy potravinárskych výrobkov z izgeneticheski modifikovanej istochnikov-- materiály odrážajú lekársky - genetické pischevoyproduktsii odhad získaný z geneticky modifikovaných istochnikov-- materiálov, ktoré odrážajú technický Vlastnosti skie pischevoyproduktsii získaný z geneticky modifikovaných istochnikov-- materiálov odrážajúcich lekársku - Biologické hodnotenie pischevoyproduktsii získaný z geneticky modifikovanej istochnikov.4.4. Objem a program práce na hodnotenie kvality ibezopasnosti potravinárskych výrobkov odvodených od geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov určeného rezultatamekspertizy prezentované materialov.4.5. Práce na posúdenie kvality a bezopasnostipischevyh produktov z geneticky modifitsirovannyhistochnikov, firma - výrobca poskytne vzorky výrobkov, vkolichestve potrebné dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6. Na základe vyšetrenia podľa imaterialov dokumentov a výsledkov lekársko - genetických, technologických a medicínskych - biologický výskum produktsiitsentr sanitárnych - epidemiologické noriem, gigienicheskoysertifikatsii a odbornosť ruské ministerstvo zdravotníctva pripravuje blankregistratsionnogo certifikát (alebo odôvodnené stanovisko obotkaze) a prenáša ju na podpis odboru gossanepidnadzoraMinzdrava Rusku. Osvedčenie o registrácii podpisyvaetsyaGlavnym stav sanitárne lekár Ruskej federácie, absencia AB - generálny štátnej zdravotnej a epidemiologický oddelenia, námestník generálneho gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Medico - genetické posúdenie potravinárskych produktov z geneticky modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost vykonávať akékoľvek výskum dannomurazdelu pre každý konkrétny druh potravín, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov určená odbornej stredisko "bioinžinierstva" Ruská akadémia vied. Techniky opísané v bodoch 5.1 - 5.3 sú nutné priprovedenii lekársku - genetické hodnotenie potravinárskych výrobkov odvodených z geneticky modifikovaných istochnikov- metód uvedených v bode 5.4, možno odporučiť kakdopolnitelnye.5.1. Analýza zariadení RAPD genotipovNeobhodimoe a reaktivyOborudovanie a prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye typ Eppendorfových skúmaviek a 1,5 ml 0,5 (k dispozícii z DNA-RNA-nejasností ASE firmy Alpha) terka potiahnuté teflónom a / alebo sklenené tyčinky pod razmermikrotsentrifuzhnoy rúrok 1,5 ml *>stolová mikrocentrifugačných Eppendorf (Theta 20 200000ob. / min.) *>Automatické micropipette variabilný objem (Classic / študenta 0,5-10 mkl- 5-40 mkl- 200-10000 L) pre mikropipety tipy (tip "micro" a konvenčné) Lednice (vzorka chladič) *>Plávajúce statívu - "vor" probirokVesy mikrocentrifuze 0,5 kgMikroanklav - "tlak sporák"BidistillyatorDNK-cyklovač ("Amplitúda-4") Elektroforetické separáciu zariadenie DNKv fragmentov elektroforesou na agarosovém gélu: zdroj napätia pre elektroforézu (NPC) 300 *> a zariadení pre horizontálne mini - elektroforéza (mini-kamera) *>UV osvetlenie pre vizualizáciu výsledkov elektroforézy DNA (transiluminátor - UVT) *>SLR-type "zenit" Typ oranžová svetofiltromFotoplenka "Mikro-200"(termostat"Temo 24-15") Shaker (3D), typ Mikrovstryahivatel rúrky Vortex (Theta 2 alebo 4) *>RN-metrFitotron pestovanie (99 fytotronu) Tabuľka laminárne box (BL-1) ------------------------------- - *> Označovanie výrobkov, ktoré sú vyrábané v podniku"Biokom", Moskva, Rossiya.Neobhodimye činidlá a rastvoryReaktivyTris (hydroxymetyl) aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy alkoholu 96% agarózovom pre elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor pre amplifikáciu DNA (Biomaster - - Taliansko - Rusko, Moskva) Príprava hlavnej rastvorov1 M Tris pH 7,5 , 121,1 g TRIS v 800 ml vody.Dovesti pH na požadovanú hodnotu rozpustite kontsentrirovannoyHCl a doplní na 1 liter. Roztok prosterilizovat.0,5 M EDTA pH 8,0. K 186.1 g EDTA pridá 800 ml vody.Dovesti pH na 8,0 NaOH.5 M Náci (reagentné činidlo alebo analytickej kvality). 29,22 g chloridu sodného sa rozpustí v 80 ml vody a doplní sa na 100 ml, prosterilizovat.10 percent SDS. 10 g SDS sa rozpustí v 90 ml vody, chtobyuskorit rozpustení sa roztok môže byť zahrievaný na 60 ° C. C. DovestipH na 7,2 pridaním niekoľkých kvapiek koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej idovesti na 100 ml. Varovanie! Pri vážení BL litsomasku nasadiť, pretože v kontakte s sliznici nosohltanu etotletuchy prášku je veľmi razdrazhenie.Ekstraktsionny pufra (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 percenta SDS). Na prípravu 100 mlekstraktsionnogo pufra vyžaduje 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5 ml M NaCl, 5 ml 0,5 M EDTA a 5 ml 10 percent SDS. Roztok sa doplní na 100 vodoyobem ml.5 M acetátu draselného. 49,1 g octanu draselného sa rozpustí v 80 ml vody tak, aby na objem 100 ml.70 percent etanolu. Na prípravu 100 ml rastvoratrebuetsya 73 ml 96% etanolu a 27 ml vody.TVE 5x pufra (0,089 M Tris - základňu bornayakislota 0,089 M, 0,002 M EDTA, pH 8,0). K 1 litra roztoku vyžaduje 54 gTris, 27,5 g kyseliny boritej (analyticky čistý), 4,6 g Na2EDTAx2H20. Dlyaprigotovleniya elektróda-0,5x TBE vyrovnávacej pamäti musí stokovyybufer zriedi 10 krát destilovanou vodoy.Bufer pre nanášanie vzorky-6x (0,25-bromfenolovyysiny percent, 30 percent glycerolu, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 g nanášacie pufer vyžaduje 2,5 mgbromfenolovogo modrá, 3 g glycerolu, 0,1 ml Tris, 0,02 ml 0,5 MEDT pH 8,0.Rastvor etídiumbromidu (10 mg / ml). 1 gbromistogo Ethidium 100 ml vody sa rozpustí. Pre vizualizáciu DNA v roztoku agaroznomgele používa v koncentrácii 5 ug / ml. Varovanie! Vsemanipulyatsii etidiumbromidom a roztokom DNA vykonávať vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya z rastlinnej tkaniva produkujúce rastlinná semená, hľuzy alebo drugoyrastitelny materiál klíčiace za kontrolovaných podmienok dopolucheniya čerstvých listov alebo rastlinné tkani.Vysechku liste získaných uzatvorením veka tipaEppendorf trubky 1,5 ml alebo 10-14 mg tkaniva (pri vysechkupoluchit ťažké) v400mlekstraktsionnogo intenzívne homogenizuje pufra (potrebné roztoky a chemikálie) s pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. Na izoláciu DNA je lepšie, aby sa mladé listy smyagkimi tkaniva bez viditeľných stôp deštrukcie. Teflon pestikdolzhen priľnúť k stenám rúrok. Skúste maksimalnominimizirovat doby homogenizácie. Homogenizácia olovo dointensivnogo farbením zelená extrakčnej bufera.Probirki s homogenátu trepe po dobu 5 sekúnd. na Vortex.Pomestit ultrathermostat skúmaviek a inkubuje sa pri 65grad. C 15 min., Obsah sa pravidelne miešania probirkimyagkim pokachivaniem.Dobavit do skúmavky v 200 ul 5 M octanu draselného (vopred ochladené v chladničke), obsah skúmaviek a tschatelnoperemeshat svetla vzorky vstryahivaniem.Inkubirovat v ľadovom kúpeli na vzorku 15 min.Tsentrifugirovat v stolnej centrifúge pri 16000 g 20min. pri izbovej temperature.Ostorozhno vybrať 400 ul supernatantu do čistých skúmaviek iosadit dva objemy 96 percent etanolu (chladených) jemným miešaním. V tomto okamihu môžete sledovať obrazovaniemalenkoy "medúza" alebo jemne dispergované suspenzie. Nechať probirkina tabuľka 5 vzoriek min.Tsentrifugirovat v stolnotenisový centrifúge pri 16000 g, 10 min. pri izbovej temperature.Osadok DNA plákania chladí na teplotu -20 ° C. C-70 protsentnymetanolom a odstredí rovnakým spôsobom ako je popísané v predchádzajúcej punkte.Rekomenduem tento postup opakovať raz raz.Slit supernatantu a pomocou mikropipetkimaksimalno odstránenie kvapalných zvyškov z DNA probirki.Osadki suchých otvorením veka probirok.Primechanie. Dávajte pozor, aby ste presušeniu zrážanie DNA, DNA t.k.peresyhanie vedie k zlej rozpustnosti vo vode.Rastvorit DNA v 100 ul sterilnej redestilovanej koncentrácia ideionizirovannoy vody.Izmerit DNK.Amplifikatsiya genómovej DNKAmplifikatsiyu genomická DNA sa vykonáva v 25 ul reakčnej zmesi (67 mM Tris-HCl pH-8,8- 16 mM (NH4) 2SO4- 2 mM MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 mM každého dNTP- dvadsať dva hodín / ml 25 praymera- mkggenomnoy DNA a 0,5 jednotiek. Taq-polymerázy) , Všetky zložky s výnimkou DNA sú súčasťou súpravy pre amplifikáciu Biomaster.Sterilnye firmy Eppendorf typu trubka 0,5 ml a umiestni vshtativ podpisat.V jednej z rúrok, ktoré majú tvoriť reaktsionnuyusmes postupne pridávaním zložiek, ako je uvedené v príprave reakčnej zmesi primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Zloženie | V jednej vzorke, l | Na 7 vzoriek L | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | reakčný pufor bez | | || MgCl2 (10x) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ -------------- + ---- + -------------- + | MgCl2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | Zmes dNTP`s | 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | Primer (4 AU / ml) | 0.5 | 3,5 | + ------------------------------ -------------- + ---- + -------------- + | termostabilné DNA polymeráza | 0.2 | 1,4 || (4 U / ml) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | DNA | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- sa reakčná zmes zriedi v príslušných rúrkach probirkam.Vnesti genómovej DNA a opatrne odpipetuje dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo olej (asi 17 ul), čo odstránenie vzduchových bublín trubiek vtechenie sekúnd odstreďuje v stolnej centrifúge, a stojan perenestiproby DNK.Ustanovit termocykléra a spustite nasledujúci amplifikáciu DNA programu: 1 cyklus: 94 °. C - 3 min.- 36 ° C. C - 1,5 min.- 72 ° C. C- 1,5 min.- II.33 cyklov: 94 °. C - 0,3 min.- 36 ° C. C - 72 ° C 1,5min.-. C - 1,5 min.- III - 1 cyklus: 94 ° C. C - 0,3 min.-36 ° C. C - 1,5 min.- 72 ° C. C - 10 min.Primechanie. Vzhľadom k analizarekomenduem použitie veľkých chuvstvitelnostiRAPD iba jeden termocykléra a tolkoodnim vybrané sady činidiel pre amplifikáciu DNA. Vsereaktivy pre amplifikáciu a DNA prípravkov musí byť skladované vmorozilnoy komory pri teplote 20 ° C. C. znovuzmrazenie (pod -20 grad.C) prípravu tepelne výsledkov DNA polymerázy v straty eeaktivnosti.Elektroforez elektroforézou na agarózovom géli a vizualizácie produktovamplifikatsiiDlya Príprava 2 percentá agarózy nutné pridať 1 gagarozy 0,5x TBE pufer na 50 ml a dôkladne sa premieša. banka bola uzavretá folgoy.Kolbu agarózy dať do mini-autokláve alebo tlakovom hrnci iavtoklavirovat 15 min.Rasplavlennuyu agaróza sa ochladí na 50 stupňov. C a naleje vpodgotovlennuyu gélové formy, aby sa zabránilo tvorbe bublín vgele. Hrúbka gél by mal byť 0,5 - 0,7 sm.Cherez 30 -. 40 minút, kedy sa vytvorí gél, odstrániť grebenkui preniesť do elektroforetické komory, predvaritelnozapolnennuyu TBE pufra 0,5x. Gél by mal byť úplne pokrytbuferom 1-2 mm.K 2 ul nanášacieho pufra pridajte 10 - 13 l reaktsionnoysmesi obsahujúce DNA amplifikačnej produkty peremeshatpipetirovaniem a opatrne aplikovaný na jamky agarózovom gélu. V extrémnych lunkunanesti molekulárnej marker massy.Primechanie. Typicky, marker massyispolzuyut DNA fága lambda molekulárnej spracuje s štiepenia enzýmom Hind III alebo Pst I iEcoR I.Elektroforez vykonáva pri 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny, kým nedosiahne úrovne 1 cm od okraja gélu. Typicky elektroforezdlitsya 3-3,5 chasa.Dlya vizualizáciu amplifikovanej fragmenty DNA gelpomeschayut v roztoku etídiumbromidu (5 mg / ml) a provodyatokrashivanie dobu 20 min. Na kachalke.Primechanie. S roztokom etídiumbromidu a spustiť v farebnom gelemneobhodimo perchatkah.Chtoby zníženie pozadia fluorescencie spôsobená bromistymetidiem sa gél premyje dvakrát destilovaná voda pripostoyannom pokachivanii.Primechanie. Predĺžené umývanie gélu môže viesť kischeznoveniyu slabiny a erózie spektra náležite diffuzii.Gel umiestnené na transiluminátor filtra a pohľad vprohodyaschem ultrafialovým svetlom cez ochranný štít a špeciálne zaschitnyeochki. Ak je to nutné RAPD spektra oranzhevyyili fotografoval cez červený filter na type filmu "mikro", Fragmentyamplifitsirovannoy DNA po pôsobení etidiumbromidom pod UV budutflyuorestsirovat oranžovej tsvetom.Primery pomocou analýzy RAPD pre identifikatsiigenotipov kartofelyaV papiera 19 použité dekamerní primérov. zemiakový Spektryamplifitsirovannoy DNA mal veľké kolichestvofragmentov rôzne dĺžky. RAPD analýza spektra stupňa kartofelyas použitie primeru PTA-19 boli zistené významné druhy polimorfizmmezhdu (obr. 1) *>, Získané údaje ukazujú niektoré variabilita osuschestvennoy intravariety starinnyhotechestvennyh odrôd. Používanie chislapraymerov obmedzená na rôznych tried získaných spektier RAPD spetsifichnyedlya samostatnú triedu. Analýza spektra umožňuje DNA vyyavitneznachitelnye rozdiely medzi blízko príbuzných tried aj tychto boli vyrobené ako somaklonálnej varianty jednej a identifikácia analýzy prípadov BTEX zheroditeley.Osnovannaya DNA môže byť použitá, keď odrody nemožno spoľahlivo odlíšiť elektroforéza porezultatam proteín, vrátane analýzy vsehstadiyah v priebehu vývoja rastliny. vyvinuli rýchlu metódu pre izoláciu DNA z glazkovkartofelya a RAPD technika, ktorá pomáha znížiť čas a stoimostanaliza. Identifikácia odrôd analýzy DNA môžu byť sdelanamenee ako 24 ch.Kontrol somatických zmien v genóme a vypestované invit0ro transformovaných zemiakov na rovnakých primérov dokazalvysokuyu účinnosť DNA analýzu pri identifikácii genotipovrasteny (obr. 2) *>.-------------------------------- *> Výkresy nie sú privodyatsya.Zaklyuchenie. Navrhovaný izolácia mikrometóda genómovej DNA izrastitelnogo materiál pre RAPD-analýzy je rýchly, ekonomický, pretože nevyžaduje nákladné zariadenie ireaktivov v porovnaní s inými metódami molekulárnej otsenkirastitelnyh genotypov, a tiež ľahko uskutočniteľný. Rastitelnyymaterial možno považovať z poľa skleníka a pestované vlaboratornyh podmienok. To nevyžaduje mikrometóda bolshihkolichestv rastlinné tkaniva (1-20 mg), ktorý je bolshimpreimuschestvom v porovnaní s inými metódami, pretože zariadenie pre ďalšie pozvolyaetsohranit raboty.Perechislennyedostoinstva tejto metódy je veľmi pohodlné pri práci s veľkým počtom vzoriek pre hmotnostnú analýzu a tiež priizuchenii jednotlivé genotypy rasteniy.5.2. Určenie, či transgénne DNKv polotovary pitaniyaStandartno opredeleniyanalichiyachuzherodnogo prijatý metódy genetického materiálu a jeho produkty yavlyayutsyaimmunologichesky analýzu a identifikáciu transgénnej DNA na pomoschipolimeraznoy reťazovej reakcie (PCR). Táto štúdia pischevyhproduktov, vyrába počnúc selskohozyaystvennoesyre podrobí tepelnému spracovaniu, môže dať immunologicheskiyanaliz nestabilné a zle vosproizvodimyerezultaty ako denaturované proteíny často nie sú sposobnyvstupat špecifickú reakciu s protilátkami proti natívne belku.Polimerazno - reťazová reakcia v tomto zmysle má tempreimuschestvom, že tepelná úprava suroviny neovplyvňuje nakachestvo DNA ako templátu, a preto obsiahnuté v produktahpitaniya a polotovary max reziduálne DNA surovina priprovedenii PCR dáva rovnaké výsledky ako natívny kritériá DNK.Vtorym vybrať PCR ako metóda pre analýzu citlivosti yavlyaetsyavysokaya prekonal aspoň dvaporyadka metodov.Pomimo známe imunologické citlivosti PCR je oveľa lacnejšie a boleestabilnym spôsob ako iné metódy analýzy. Odnimnemalovazhnym Ďalšou výhodou je, že PCR syntetické oligonukleotidy použité vreaktsii ak správne vyboremogut byť použitá pre analýzu rôznych transgénov, že v prípade imunologických metód nevozmozhno.Metody určenie, či transgénne DNKv hotové potravinárske výrobky pomocou polimeraznoytsepnoy reaktsiiVydelenie produktaV DNA z je vybraný skúšobnej metódy prideľovania DNA rozhodujúcu úlohu igraetsoderzhanie oleja v potravinárskych výrobkoch. So zvýšenou soderzhaniimasla (čokolády, rafinovaný rastlinný olej, atď) Ďalšie extrakcie suspenzie nepolyarnyhrastvoriteley s vodou. To umožňuje prenos DNA obsahovala vpischevom produktu vo vodnej fáze, v ktorej čistenie proizvoditsyadalneyshaya. Pre konečnú techniku ​​čistenia ispolzuetsyaoriginalnaya vyvinuté v stredu "bioinžinierstva"Zvyčajne je dĺžka fragmentu PCR pri identifikácii transgénnych DNA neprevyshaet 1000 párov báz, ale nizhesleduyuschihmetodik tvoril základ pre izoláciu a čistenie, aby poluchitdostatochno čisté DNA prípravky pre PCR. Vtorymkriteriem techniky vzorkovania bola požiadavka, aby sa minimalizoval čas strávený o pridelenie jedného DNK.Metodika1 lieku. 0,5 g vzorky potraviny sa homogenizuje s teflónovým piestom alebo pomoschisteklyannogo v 0,5 ml pufri A (100 mMt0ris-HCI, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mM beta-mercaptoetanolu) 0,2. Po homogenizácii, 100 ul 20% SDS. Smestschatelno zmiešané a inkubované po dobu 20 - 30 minút. pri teplote 65 stupňov. C.3. Ochladí sa na 4 ° C. C, sa pridá 0,3 ml 5 M acetátu draselného, ​​zmes sa mieša vírením a centrifugovány po dobu 10 minút. na 15000ob. / min. v centrifúge pri izbovej temperature.4. K supernatantu sa pridá 1 ml Wizard živice MaxiPreps (Promega, USA) a zmes bola inkubovaná po dobu 10 minút. pri teplote 25 stupňov. C.5. Potom bola výsledná zmes sa čerpá mini kolonkuWizard (Promega, USA), premyje sa 2 ml 80 percent izopropanolu, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem v mikroodstredivke (15000 ot. / Min., 2 min.). 6. Mikrokolona pridaná v 50 ul destilovanej vody, zohriatej na 65 ° C. C.7. Inkubuje sa mini - stĺpec vody 10 minút. pri teplote 65 stupňov. C, iotzhimayut roztoku DNA do čistej sterilnej mikrotsentrifuzhnuyuprobirku odstreďovaním v mikroodstredivke (15000 otáčok / min po dobu 2 minút, ...) v závislosti od obsahu DNA určité potraviny pridržiavacie jednotky polymerázy -. Reťazová reakcia objem 50mkl vyžaduje od 2 do 20 ul výslednej DNK.Obraztsy prípravu potravín so zvýšeným obsahom oleja peredvydeleniem DNA, ktorá má byť podrobená ďalšie ekstraktsiiemulsiey chloroform vode.Dlya 0,5 g produktu sa homogenizuje smesi0,5 ml pufra a a 0,5 ml chlorofylu jarmo 20 a homogenizát sa inkubuje min.pri 56 ° C. C. Potom sa zmes ochladí na teplotu 4 ° C. C a tsentrifugiruyut10 min. pri 15000 ot./min. / min. v mikrocentrifuze pri izbovej temperature.Vodnuyu fáza sa oddelí a prenesie sa do čistej skúmavky. Daleeprodolzhayut z kroku 2 vyššie uvedeného vyplýva, metodiki.Vybor priméry pre PTsRDlya presne určiť prítomnosť transgénnej DNA za poskytnutie firma poskytuje informácie molekulyarnoystrukture transgénu vložku, a to jeho nukleotidnayaposledovatelnost. Táto požiadavka je predstavený canwas presne určiť prítomnosť špecifických geneticheskoykonstruktsii. V tomto prípade, budú syntetické oligonukleotidy byť syntetizované pomocou PCR dlyaprovedeniya takže prítomnosť vyyavitfakt transgénu kódujúce oblasti. Dĺžka prianalize špecifické primery použité by mala byť aspoň 25 parnukleotidov, aby sa zabránilo vzhľad v dôsledku reakčných produktov PTsRnespetsificheskih prípad, kedy nemozhet byť reprezentované ako informácie z nejakých dôvodov (napríklad firma - proizvoditelproduktov napájanie procesora je len proizvodimogodrugoy organizácia transgénne surovina ) provoditproverku potreba na prítomnosť vylučovaných testovaných výrobkov DNKnabora štandardné expresné kazety používané v m rovoypraktike k produkcii transgénnych rastlín. Pre tých, otnosyatsyapraymery k identifikácii génov selektívny marker rezistencie (rezistencia na neomycín gén NPT II a Hygromycin HVT), atakzhe štandardne používané oblasti promótorom (promótor e35S virusatsvetnoy kapusta, atď.), .Vybor podmienky PTsRDlya analýzy za použitia štandardných primerov vo svete ispolzuyutobscheprinyatye podmienky PTsR.Dlya prípady špecifických primerov provedeniyaPTsR podmienok výberu sa vykonáva pre každý jednotlivý prípad otdelno.Apparatura použiteľné v PCR Analýza eerezultatovAnaliz prítomnosť transgénu vložiť DNA obsahovala vproduktah energie sa vykonáva v DNA termocykléri "VP-4"vyrábané "Biocom"Moskva. Temperovanie obraztsovosuschestvlyaetsya na suchých termostatov "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskva. Pre PCR Taq vyrobeného ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskva. Analizproduktov PCR bola vykonaná za použitia reštrikčné analýzou etihproduktov elektroforézou na agarózovom géli a výsledný vzor na posleduyuschegofotografirovaniya transiluminátoru firmy UVTIproizvodstva "Biocom"Moskva, na film "mikro -Izopan" pomocou fotoaparátu "zenit" alebo v digitálnej podobe pripomoschi digitálny fotoaparát "Kodak DC 120".Fotootpechatki alebo odtlačky vyrobené na laserovej tlačiarni s rozlíšením aspoň 600 bodov na palec, musí byť pripojený k kprotokolu ispytaniy.5.3. PCR identifikačný blizkorodstvennyhshtammov bakteriyV súčasnej techniky molekulárnej biológie sú založené naprimenenii polymerázová reťazová reakcia (PCR) sú boleeshirokoe použitie na diagnostické účely a expresné - analizaraznoobraznogo biologický materiál. Intenzívne razvitiepodobnyh metódy vzhľadom na veľmi vysokej citlivosti PCR, možnosť rýchle výsledky (v odnogorabochego dňa), nízke náklady na získaných výsledkov (v porovnaní s inými metódami) a spracovateľnosti (vozmozhnostyuorganizatsii aktívny hladine prakticky lyubyhusloviyah do Mobile Express - laboratóriá) .Other molekulárne - biologické metódy alebo vyžadovať dlyasvoey realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih laboratória alebo poskytovať rez ultaty s nizkoydostovernostyu.Tipichny napríklad nemožnosti dostovernoyidentifikatsii - fylogenetickej analýzy príbuzných druhov ponukleotidnoy 16SpPHK sekvenciu génu. Takéto analizyavlyaetsya obvyklé pre úplný opis novo objaveného vidovbaktery ale dáva nízke spoľahlivosti popytkerazlichit úzko príbuzných druhov, ktoré sa vyskytujú v priemyselných kmeňov sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy B.anthracis.Metod bacily alebo baktérií Identifikácia pomocou PTsRVybor metodaSredi založený na použití PCR molekulárnej - štúdie biologicheskihmetodov biodiverzita najvhodnejšie pre tseleyidentifikatsii baktérií je metóda tzv DAF-PCR, vyvinutý Caetano - Annoles (Caetano o - Annoles G, Bassam ako J, Gresshoff PM (1991), DNA amplifikácia fingerprinting pomocou veryshort arbit0rary oligonukleotidových primérov, Bio / Technology 9: 553 -556) .. Rovnako ako u iných spôsobov, ktoré buď vyžadujú slishkomobshirnoy informácie o štruktúre genómu určitého organizmu (priame detekciu kmeňa - špecifických génov), alebo poskytnúť nepolnuyudlya identifikáciu blízko príbuzných informácií druh (RAPD-PCR, DALP-PCR), alebo príliš zložité a nákladné, a nemôže bytrekomendovany pre široké použitie (AFLP-PCR) .Edinstvennym úzkym miestom v DAF-PCR je výber vhodného dlyatochnoy identifikácie krátkych oligonukleotidov praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "bioinžinierstva" RAS programmnoeobespechenie pre Analýza nukleotidovej sekvencie polnyhgenomnyh baktérií umožňuje výber oligonukleotidnyhpraymerov pre DAF-PCR, poskytuje dôveru identifikatsiyubaktery na úrovni kmeňa, čo zodpovedá individualnymrazlichiyam pre človeka a iných vyšších eukaryoty. Takéto rabotaprovedena pre identifikáciu príbuzných baktérií skupiny. anthracis, pre ktoré Identifikácia pomocou standartnyhmetodov (fylogenetické analýzy nukleotidovej posledovatelnostigena 16SpPHK) sa bezuspeshnoy.Vybor podmienky PTsRUsloviya reakcie určiť stupeň presnosti ivosproizvodimosti výsledky a mal by byť držané za konkretnoygruppy bakteriy.Sozdanie elektronickej databázy dannyhDlya úplnú a spoľahlivú identifikáciu špecifických mikroorganizmaneobhodimo vytvoriť elektronickú databázu o konkrétnom gruppebaktery, ktorý obsahuje údaje o maximálne WHO mozhnomchisle rôzne dostupné ako čisté kultúry alebo kmeňov kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee spoľahlivé výsledky v PCR sa získa DNA vydelennayaneposredstvenno pred riadiť reakciu zamorozhennoybakterialnoy pasta metódou spoločnosť Promega živice (USA) pomodifitsirovannomu kontaktu a Birnoboyma pomere: - 20 až 40 ul na rozmrazené Bakteriálna 100mkl hmoty suspenduje v pufri aj (50 mM t0ris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, / ml 50 mkg RNáza) suspenzie .K sa pridá 120 ul lyzačného pufra (0,2 M NaOH, 1% SDS) a očakávať bakteriálne lýzu ako je vidieť stúpajúci Visco stisuspenzii. Potom, bakteriálne proteíny a komplex oblomkovkletochnoy stena vyzráža pridaním 100 ul 2,55 M octan kaliyapri intenzívneho pretrepávania na vortexe po dobu 5 minút. Zhestkoevstryahivanie vortexe nutné porvatdlinnuyu bakteriálnej DNA, ktorá bola prichytená k membráne vneskolkih bodov, inak klesá osadokvmeste s komplex SDS-proteínu. Zmes sa potom odstredí namikrofuge na 5 - 10 minút. Supernatant bol prenesený do mikrocentrifuze mlprobirku 1,5, ktorý obsahuje 0,75 ml živice "Wizard PCR-Prep"alebo "Wizard mini prep" Spoločnosť Promega. Zmes bola dôkladne peremeshivayuti je čerpaná cez mini-kolóny, sa živica premyje zrazenina Vmin stĺpec 2 ml 80% izopropylalkoholu, odstredí v mikroodstredivke 1 min. pri maximálnej rýchlosti, aby sa odstránili zvyškové kvapalné iminikolonku umiestni do sterilného 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmavky, ktoré boli malé - stĺpec 50 l sterilnej redestilovanej vody a zahrieva ilideionizovannoy stĺpci trubice 5 minút. Pri 70grad. C. Potom sa mini - stĺpec v trubke je umiestnená v mikrocentrifuze po dobu 1 minúty itsentrifugiruyut. pri maximálnej rýchlosti perenosarastvora DNA v skúmavke. Popísaný spôsob je poradie 5 mkgDNK. Veľkosť výslednej DNA - od 3 do 15 kb, oddeliť, že vpolnedostatochno 16S RNA z baktérií (asi 1500 bp priispolzovanii pár priméru 11F / 1492R). Poskytnuté ispolzovaniyasterilnyh riešenia a riad Získané DNA môžu byť skladované pri teplote + 4 ° C. C po dobu šiestich mesiacov. Čas použiteľnosti DNA prípravky pri teplote 20 ° C. C presahuje 2 goda.Ispolzuemye činidiel a oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"VP-4"vyrábané "Biocom"Moskva. Temperovanie obraztsovosuschestvlyaetsya na suchých termostatov "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskva. Pre PCR Taq vyrobeného ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskva. Analizproduktov PCR bola vykonaná za použitia reštrikčné analýzou etihproduktov elektroforézou na agarózovom géli a výsledný vzor na posleduyuschegofotografirovaniya transiluminátoru firmy UVT1proizvodstva "Biocom"Moskva, na film "mikro -"Izopan" pomocou fotoaparátu "zenit" alebo v digitálnej podobe pripomoschi digitálny fotoaparát "Kodak DC 120", Iliottiski fotografické výtlačky vyrobené s rozlíšením laserovú tlačiareň nie je menee600 dpi, musí byť aplikovaný na provedeniyaispytany protokol. Oligonukleotidové priméry boli syntetizované v Centre"bioinžinierstva" RAN.5.4. Metódy na stanovenie celkovej svoystvgeneticheskoy vstavki5.4.1. Izolácia genómovej DNA pomocou PCR a správanie. Pre izoláciu genómovej DNA zo vzorky produktu mozhetprimenyatsya fenol - chloroform alebo inej vhodnej metódy [124]. Výsledné DNA prípravky sú skladované pri mínus 70 ° C. C iispolzuyutsya pre rozbor pomocou PCR (NRP). Oligonukleotidové priméry pre PCR môžu byť predostavlenyfirmoy - výrobca produktov, alebo môžu byť syntetizované v súlade s pozakazu údaje vstavki.5.4.2 štruktúry. Pri vykonávaní PCR za použitia Taq-DNA-polimerazaproizvodstva IBCh. V objeme typických experimentoch polimerizatsionnuyusmes 50 ul je konštruovaná tak, aby obsahovala 350 nggenomnoy DNA, 1,5 mM každého z chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov (firma MBI Fermentas Litva), 1 jednotka. Taq-polymerázy. Potom sa do polymeračnej zmesi pridá 30pkM pár oligonukleotidových primerov v rastvoresleduyuschego zložení pufri: 67 mM Tris-HCl-pufra (pH 8,0 pri 25 ° C), obsahujúci 16,6 mM síranu amónneho, 67 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoetanolu, 6 , 7 mM EDTA, a bovínnej sérový albumín vkontsentratsii 170 ug / ml. Ďalej, každá vzorka bol navrstvený 50mkl minerálneho oleja a reakcia bola vykonaná v súlade s programami, špeciálne upravené pre lokálne špecifickú DNA génu termocykléri vmnogokanalnom "Termtsik" výroba JSC"DNA technológie" (Moskva) .Ak je to nutné, možno vykonávať viacnásobné PCR dlyaanaliza niekoľko dôležitých vstavki.Produkty fragmenty amplifikácie sa analyzovali elektroforézou vplastine 6 percent na polyakrylamidovom géle (2,5 hodiny pri 200 V) DNA-markery je štandardná sada fragmentov DNA plazmidypBR322 získané podľa pôsobenie reštrikčného enzýmu Alu 1 (firma MBIFermentas). Farbenie fragmentov DNA sa vykonáva s etidiumbromidom. Analýza výsledkov a fotografovanie elektroforegrammyosuschestvlyayut v usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. Metódy hodnotenia vstavki5.5.1 prevádzku. Stanovenie mRNA produkované vloženie, do rastlinného genómu kotorayavvedena použitím nested PTsR.Vydelenie celková mRNA prípravky zo vzoriek produktaguanidin - Tiokyanatan - fenol - chloroform metóda [125] iprovedenie následné vnorovanie PCR primérov s deklarovanou [126, 125]. Detekcia syntetizovanej elektroforézy cDNA vpoliakrilamidnom gélu farbením etidiumbromidom [126] .5.5.2. Dvojrozmerná elektroforéza belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie činidlá: akrylamid, methylenbisakrylamidu, agaróza, Tris, glycín, dodecylsulfát sodný, persíran amónny, Triton X-100, ditiotrietol Amberlite MB-1,2-mercaptoetanolu, Coomassie Brilliant Blue R-250, modrá kumassibrilliantovy G-250, Tween-20, 4-chlór-l-naftol, bychiysyvorotochny albumín - firmy "serva" (Nemecko) - Tween 20 - firmy"Merk" (Nemecko) amfolinů pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, firmy"LKB" (Švédsko) .V kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: nitrocelulózové - firmy "Schleicher a Schull"(Nemecko) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov extrakty pripraví podobným spôsobom za použitia obespecheniyamaksimalnoy solubilizáciou proteínov lyzačný roztok (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih činidlá - močoviny mercaptoetanolu (ditiotrietola) a Triton X-100. LR - 9 riešenie Mmocheviny s obsahom 5% 2-mercaptoetanolu, 2% Triton X-100, 2% amfolinů 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala močoviny rozpustí vdeionizovannoy vodu a ďalej čistená pridaním AmberlitMV-1. Po 10 min. Inkubácia Amberlite rastvorumocheviny oddelí a pridá Triton X-100, ditiotrietol (alebo 2-mercaptoetanolu), amfolinů pH 3 - 10 na extrakciu uvedených proteínov kontsentratsiy.Pri Vzorky tkaniva boli mleté ​​nožnicami ineskolko časy s chladným soľným roztokom. Zatemizmelchennuyu Tkanivo sa homogenizuje v homogenizátora sklo steflonovym HR paličkou v pomere 100 mg v 2 ml tkanivovej LR itsentrifugiruyut pri 700 g počas 10 minút. Frakcia Supernatant obsahujúci rozpustené proteíny (extrakt) bol použitý dlyadalneyshey analýza raboty.Dlya proteín za použitia dvojrozmernej elektroforézy poO`Farrellu - spôsob, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom gél v prítomnosti SDS [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie vykonávané v sklenených skúmavkách dlinoy150 mm a vnútorný priemer 3,5 mm. Rúrka upravené vshtativ, spodné otvory uzatvorené a Parafilm filmu zalivayutpolimerizatsionnoy zmes. Kompilácia polymerizácie smesigotovyat nasledujúcich reakčných činidiel: 1.1. 30 percent akrylamidu, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Triton X-100.1.3. 10 percent persulfát ammoniya.1.4. Anóda vyrovnávacej pamäte pre izoelektrickým zameraním: 0,01 Mfosfornaya kislota.1.5. Katóda vyrovnávacej pamäte pre izoelektrickým zameraním: 0,02 M NaOH.1.6. Ochranný roztok: 4,5 M roztok močoviny, obsahujúci 1% Triton X-100- 2,5% mercaptoetanolu, 1% amfolinů pH 3,5 - 10.1.7. Premiestniteľná pufra pre gélovú prvom smeru - belkovyybufer (.. pozri časť 2.2) Roztok 1,1- 1.2- 1,6- 1,7 skladované pri 4 ° C. Con 2 - 3 týždne. Iní používajú svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 ml polymerizačnej zmesi požadovanej dlyazapolneniya rúrok 12, vykonáva zmiešaním 12 g močoviny, 6,75ml destilovanej vody, 3 ml 1,1 ml 2,25 rastvoraTritona X-100 (20%). Táto zmes sa spracuje s iónovo-výmennou smoloyamberlit MB-1, sa odfiltruje a k roztoku sa pridá 225 ul amfolinovpH 3,5 - 10 a 900 ul amfolinů pH 5 - 7. Zmes sa zbaví plynu, pred naliatím do aneposredstvenno skúmavky, do ktorej bolo pridané 22,5 a 32,5 mklTEMED l 10 percent roztoku PSA.Polimerizatsionnuyu zmesi bolo do skúmavky pomocou injekčnej striekačky, zapolnyayatrubki zdola nahor na rovnakej úrovni po dobu 2 - 3 cm pod verhnegokraya (gél výška stĺpca 11 cm). Horný uzáver vodu.Posle vrstvené gélová polymerizácie vody cez jeho poverhnostyuudalyayut rúrky a umiestni sa do komory gelelektroforeticheskuyu"Bio-Rad"Model 175 (US). V spodnej komore nalivayutrastvor katódovej pufra. Vzorky trubiek, ktoré majú byť analyzované aplikuje vobeme 50 - 150 ul (100 ug proteínu). Variantefraktsionirovaniya aplikuje objem polo vzorky sa zvýši na 250 - 350mkl. Z vyššie uvedeného okraja rúrky sú vrstvené ochranný roztok 1,7 iverhnyuyu zariadenie anódová komora je naplnená do rovnováhy buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii vykonáva od 400 V do 200 V.ch, a potom na napryazhenii1000 V 5400 V.ch súčte hodnoty, alebo (v noci režim) v 210 prinapryazhenii dvadsať hodín a potom jedna hodina 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya aby vykonávať pri napätí v rozmedzí od 400 V.ch SAR 200, a potom na 1000V V.ch na celkový znacheniya1000 - 2500 V.ch .po end izoel na kolóne ktrofokusirovaniya nasiaknuté B5 prevoditeľné ml pufra (roztok 1,7), 10 min. Pri komnatnoytemperature. Potom sa gély nie sú určené pre nemedlennogofraktsionirovaniya v druhom smere, ihranyat rýchlo zmrazené pri teplote -20 ° C. C na niekoľko nedel.Dlya druhej frakcionácie napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny metódy Laemmliho [130] v doskách s gradientom PAAG7,5 - 25% v prítomnosti SDS.Dlya tento účel sú tieto roztoky sa pripravujú, z ktorých zatemsostavlyayut polymerizačnej zmesi za vzniku dosky PAGE: 2.1. 60 percent akrylamid, 0,8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. Pre gélové pufra deliacej: 1 M Tris-HCl (pH 8,8), .2.3. Pufor pre stohovanie gélu: 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), .2.4. 10 percent dodecyl natriya.2.5. 10 percent persulfát ammoniya.2.6. Elektródy elektroforéza pufer: 0,025 M Tris, glycín 0,192, 0,1 percenta SDS (pH 8,3), .2.7. Agarózovom gélu 1% roztok agarózy s dobavleniem0,125 2,6% brómfenolovej modrej. Po varení rastvorneobhodimo varí po dobu 5 min., A pred kazhdymispolzovaniem gélu, ktoré rastopit.Rastvor 2,5 pripravuje bezprostredne pred použitím, a zvyšok bol skladovaný pri 4 ° C. Druhý smer C.Fraktsionirovanie vykonáva vplastinah strana veľkosti 160 x 160 x 1 mm, s lineárnym akrylamid gradientomkontsentratsii 7,5 - 25%, v zariadení pre vertikalnogoelektroforeza. Gél dosky pripravená štandardným steklyannyhkassetah. Príklad popisovať použitie etogooborudovaniya skôr publikovaná [131] Zvyčajne, pre tvorbu paralelných dosiek 6 gélu koncentrácie sgradientom akrylamidu (oddeľovanie gél) 2 Roztok sa pripraví svetla (koncentrácia AA 7,5%) a ťažký (koncentrácia AA25%), 100 ml každého , Úplná štruktúra týchto riešení je daná vtablitse.TablitsaSOSTAVY oddelená a zahustená gély + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Komponenty | oddeľovanie gélu | Sústredenie || + -------- + ------- + gél || | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60 až 0,8% ml | 41,8 | 12.5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1 M t0rIS pH 8,8, ml | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 M t0rIS pH 6,8, ml | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% SDS, ml | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O, ml | 20.4 | 49,3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, l | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, l | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + Heavy a jednoduché riešenia sú zmiešané s použitím smesitelGradient bývalý model 395 ("Bio-Rad", USA), alebo analogichnoeotechestvennoe zariadení, tak, aby sa získala koncentrácia lineynyygradient akrylamidu v kazetách, ktoré postepennozapolnyayutsya za použitia peristaltického čerpadla. Obvykle súčasne plnené dosky 6, ktorá zaisťuje vysokú reprodukovateľnosť identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov. Po vyplnení polymerizácii smesnaslaivayut vody. Polymerizácia trvá 30 - 40 minút. Zatemvodu odstráni, povrch gélu blotovány s filtračným papierom izalivayut roztok tvoriaci stohovacie gel.Dlya prípravu 50 ml roztoku, ktorý sa sústredí gelyaneobhodimo zložiek zmesi, uvedené v tabuľke prichemkatalizatory (TEMED a PSA) sa pridá priamo peredzalivkoy gélu. Polymerizácie sa ukončí počas 30 - 40 min.Udaliv vody na povrchu stohovanie gélu nakladyvayutgel prvý smer a naleje roztavený agarózový gél (roztok 2,7). Od okraja každej dosky je tvorená "vreckový" dlyananeseniya bielkoviny - markery. Behom 5 minút. agaróza gelzatverdevaet, zabezpečenie plnej kontakt prvý gélové napravleniyas gélové dosky, a umiestni sa do kazety dlyaelektroforeza.Elektroforez zariadení sa vykonáva v nasledujúcich režimoch: prúd 30 mA na 200 Vmaksimalnaya plastinumaksimalnoe napätie napájania 50 Vt.Elektroforez ukončená, keď predná hrana farbivá dohoditdo nižšia separačným gélom .Po dokončení frakcionácie pre detekciu proteínu nagelevyh tabúľ farbením Coomassie R-250 a dusíka -kislym serebrom.Okrashivanie proteínov Coomassie R-250 n oestriasis metoduFairbanks od [132] v roztoku 10 percent kyseliny octovej, 25-percent izopropanolu, 0,05 percent Coomassie R-250.Okrashivanie vykonáva vo vodnom kúpeli po dobu 15 minút. sposleduyuschey pranie neviazané farbivo 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku dusík - striebro sa vykonáva v kyslom modifikácii Blum [133] za použitia nasledujúcich reakčných činidiel: Roztok Ditioničitany sodného (Na2S2O3 x 5H2O), - 0,2 g / l roztoku dusíka - kyselina strieborná 200 ml - 0,4 g striebra -kislogo dusíka, 150 ul formalíne Vyvolávacia roztok 200 ml: Na2CO3 - 8 g, 4 ml rastvoragiposulfita sodného, ​​100 ul formalina.Vse striebrenie procesov, vykonáva Ak na trepačke a vplastikovyh kontajnerov. Gél po zafarbení Coomassie R-250otmyvayut maľovať 10 percent kyseliny octovej za svetlogofona. Potom trikrát 20 min. inkubované v 25-protsentnomizopropanole Removal Gel SDS, načo promyvayutdistillirovannoy voda (20 sec.). Ďalej, po dobu 1 min. gelinkubiruyut v ditioničitan roztoku a dvakrát po dobu 20 sekúnd. otmyvayutv destilovanej vody. V ďalšom kroku je gél udržiava vrastvore dusíka -. Kyslú striebro 15 minút, načo sa trikrát cca 20sek. premyjú destilovanou vodoy.Na finálnej fázy gélu sa umiestni do vyvíjacej roztok iokrashivanie zastavená premytím vodou, gél kogdana už objavujú nové pyatna.Fotografirovanie gély vykonávané v mokrom stave naplenku vysokej citlivosti (napríklad Mikro 300). Gély dlyahraneniya vysuší. Za týmto účelom boli dehydrované v roztoku, ktorý obsahuje 3% glycerolu a 50% etanolu po dobu 30 min., Zatemplotno pevne medzi dvoma vrstvami celofánu a suší sa pri okolitej vnatyanutom temperature.5.5.3. Stanovenie expresného produktu zahrnuté vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi myšiach protilátok proti proteínu kódovaného detekčné operácie vstavkoypolipeptida.Dlya produktu zo vstavkirekomenduetsya Použitie konjugátu anti-myšieho imunoglobulínu"sigma" v riedení 1: 1500 alebo konjugátu proti immunoglobulinovmyshi "Amersham" zriedený 1: 600.Na prvá analýza vykonáva stupeň elektrotransfer proteínov z PAAGna nitrocelulózový filter firmy "Schleicher a Schull"(Nemecko) v súlade s metódou Towbin [135] za použitia bufernogorastvora obsahujúceho 20 mM Tris, 0,192 M glycín, 20 protsentnyymetanol, 0,1% SDS (pH 8,3 - 8,4). Elektromigrační sa vykonáva pre vertikálne komora B špeciálnej firmy elektroblotování"BIORADE" (USA) (alebo iné podobné zariadenie) privelichine napätie 15 až 16 V a prúd 120 - 160 mA techenienochi (12 - 14 hodín) .Po okonchaniyaelektroperenosa nitrocelulózy filtrpromyvayut tromi zmenami 0,01 M PBS (sodná - fosfátového pufra, pH 7 4) 5 pre zisťovanie min.Dlya prevedená na membránový filter proteínov v techenie5 - 10 min. inkubované v roztoku farbiva (0,25% Ponceau-c, 40% kyseliny octovej, 15% metanolu). škvrna pozadí premyje 0,01MPBS.Na poslednej fáze pred väzbou monoklonalnyhantitel, filter sa premyje 0,1 M PBS, obsahujúcom 30% izopropanolu (pre odstránenie SDS), 3 x 20 min., potom päťkrát v 0,01 M 0,01MPBS a PBS-0,05% Tween-20. Sorbtsiyuantitel potlačiť možné nešpecifickej filter inkubáciou v roztoku 1% BSA v 0,01MPBS po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C. C (alebo cez noc pri 4 grad.C). Filter sa premyje 0,01 M PBS päťkrát, potom 0,1 M PBS-0,05% Tween 20 päťkrát. Konečne je držaný v rastvoresootvetstvuyuschih protilátky inkubácie v 0,1 M PBS (riedenie vybraný vkazhdom prípad). Po inkubácii s mAbs 0,1MPBS filtra bola premytá 5krát a 5krát 0,1 PBS-0,05% Tween-20 a inkubované s peroksidaznymkonyugatom proti myšiam Ig G po dobu 2 hodín pri teplote 37 ° C. C. Po pyatikratnyhpromyvok 0,1 M PBS a 0,1 M PBS-Tween-20 pufra dlyaokrashivaniya naliať filter (12 mg 4-chlór-1-naftol sa rozpustí v 4 ml etanolu, objem sa upraví na 20 ml 0,1 M PBS a pridá sa priamo peredprimeneniem 12 ul 30 percent peroxid vodíka), kým nevznikne číry prejav ivyderzhivayut zon.5.5.4 vitráží. Otsenkabiologicheskiheffektov produktu (y) funkčného vstavki.5.5.4.1. Semipreparatívne pridelenie proteínové prípravky poslefraktsionirovaniya proteínových extraktov dvojrozmerného elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh purifikovaný proteín preparatovdvumernym summarnyebelkovyeekstrakty frakčnom elektroforézou za štandardných podmienok popísaných vyššie. Potom detektsiyubelkovyh frakcie sa vykonáva v podmienkach non-lokalizáciu rastvoromatsetata 4M draslíka. Podobne frakcie boli vyrezané z 20 - 40 a oddelené kusy gelevyhplastin gély pred izoláciou uskladnili pri teplote -20 ° C. Môže C.Nekotorye Proteíny eluované difúziou. V etihsluchayah získaných kusov géloch obsahujúcich proteín s rovnakým názvom, je pozemné a homogenizuje v deionizovanej vode, a potom sa vymýva chegobelok dobu 15 - 20 minút. Homogenát gelyavstryahivaniem magnetickým miešadlom. Po odstredení vtechenie 20 min. na 700 g, supernatant sa oddelí a sosadkom postup sa ešte dvakrát opakuje. Kombinovaná Supernatant (obemokolo 50 ml) sa vysuší zmrazením, zrazenina sa znovu rozpustí v 1 - 2 mldeionizovannoy studenej vody a produkovať úľavu od izbytkadodetsilsulfata sodného. Otdelyayuttsentrifugirovaniem zrazenina (15 min. Pri 3000 g), ktorý obespechivaetponizhenie SDS koncentrácia v supernatante na 0,25% [134]. Potom otostatka soli a SDS likvidovať dialýzu proti distillirovannoyvody po dobu 12 hodín pri teplote 4 ° C. poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu proteíny C.Neelyuiruyuschiesya vykonávaná priamo v jednotke pre firmu "Bio-Rad" (USA) ilianalogichnom zariadení. Pri prvom použití dializnoymembrany (dodávané s prístrojom) sa inkubiryut vtechenie 30 min. vo vyrovnávacej pamäti elektródy pre elektroforézu (rastvor2.6) pri teplote 60 ° C. C. Fragmenty gél soderzhaschieiskomuyu frakcie umiestnený do sklenenej trubice pripojený sdializnoy membránou a naplnená elektródy pufra dlyaelektroforeza. Skúmavka bola namontovaná v zariadení, hornej a naleje nizhnyuyukameru pufra pre elektroforézu, iprotsess pripojených elektród cez noc pri konštantnej intenzity prúdu izrascheta 5 mA na skúmavku a obmedzenia napätia. Belokkontsentriruetsya v objeme asi 400 ul pufra rastvorsobirayut to, bola membrána premytá a tento roztok sa pridá časť kosnovnoy. Roztok proteínu sa potom dialyzuje proteínu metódou Bradford izmeryayutkontsentratsiyu a liofiliziruyut.V práca pre stanovenie koncentrácie proteínu razlichnyhrastvorah pomocou Bradfordovej metódy [136]. Základom metodalezhit viazania farbiva Coomassie Brilliant Blue G-250 sbelkom analizaotbirayut vzoriek rastvore.Dlya (zriedenej v sluchaeneobhodimosti), obsahujúci 1 - 10 g proteínu v 0,1 ml. K 25 mklobraztsa pridá 25 litrov roztoku farbiva, ktorý obsahuje 0,05% Coomassie Brilliant Blue G-250, 5% etanolu, 10% ortofosfornoykisloty a absorbanciu pri 594 nm. Koncentrácia Belkaopredelyayut z kalibračnej krivky zostrojené pre rastvorabychego sérový albumín ("serva".5.5.4.2). Testovanie biologické vlastnosti bunkové kultúry vložky produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya overenie biologických vlastností produktu funktsionirovaniyavstavki použitého testu - systémy založené na kultúrach ľudských fibroblastov postnatalnyhdiploidnyh predtým popísané [137] .Kultivirovanie buniek sa vykonáva v médiu DMEM (vyrobené "PanEco", RF), doplnenom 5% séra veľké rogatogoskota a 5% ľudskej pupočníkovej krvi séra (vyrobené "PanEco", Ruská federácia), a to buď sklenené fľaštičky Carrel, alebo plastikovyeodnorazovye pevné matrace "costar" (Holandsko), alebo v 96-lunochnyeplanshety firmy "nunc" (Dánsko). Ako organické krasiteleyprimenyayut vitálneho farbiva, metylénovej modrej [138] a [139] krasitelGimza (firma "Merck"Nemecko) .Na prvom stupni sa nastavuje v závislosti kolichestvomkletok medzi otvorom a intenzity farbenie metylénovou modrou, dlyachego bunky boli nasadené v rôznych hustotách v 96-jamkových planshetyi kultivovali sa po dobu 1 dňa pri teplote 37 ° C. C. Ďalšie kletkiprizhiznenno farbené po dobu 1 hodiny sa metylénová modrá, dobre vkazhduyu pridaním 25 ul roztoku farbiva. Zafarbené kletkidvazhdy premyje vodou a vysuší sa na vzduchu. Izmerenieopticheskoy materiál otvor hustota vykonávaná electrophotometer"EFOS 9305" (firma "EFOS", Rusko) pri 594 nm. Výsledky opredeleniyaopticheskoy hustotu a množstvo zaočkovaný do každej jamky kletokobrabatyvayut pomocou počítačového programu "SigmaPlot" ilianalogichnyh počítač programm.Pri štúdium vplyvu operácie vkladanie produktu naproliferativnuyu schopnosti ľudských fibroblastov na bunky rastúce v 96-jamkových doštičkách, boli pridané rôzne kolichestvapreparata proteínu a po 4 dňoch kultivácie probyokrashivayut metylénovej modrej, ako bolo popísané vyššie. Paralelné vseproby mikroskopiruyut (MBI-3 LOMO adaptirovannyykakinvertirovanny mikroskop pomocou špeciálnej trysky) dlyaotsenki morfologický stav rastúcej bunkovej suspenzie farbenie raznoyplotnosti kletok.Pered Giemsa v DMEM médiu s 10% fetálnym teľacím sérom vobeme 200 l pridaný do jamiek 96-jamkových doštičiek. Tým je riadený pervyyvertikalny počet otvorov, nie je zapolnyayutkletochnoy suspenzie. Doštičky boli inkubované v atmosfére 5 protsentnogouglekislogo plynu pri teplote 37 ° C. C. Po jednom dni kletkifiksiruyut pridá do každej jamky 50 ul holodnogosvezheprigotovlennogo 2,5 percenta glutaraldehyd. Cherez30 minút. ktorým sa pri teplote 4 ° C. C bol odstránený z držiaka jamkami lunkidvazhdy premyje sa studeným Hankův roztok a Giemsa mklkrasitelya vyplniť 100, špecifická väzba na chromatínu zriedi 1:50 pred použitím. Kletkiinkubiruyut farbivo 3 hodiny pri teplote 37 ° C. Krasiteludalyayut C. Potom boli jamky dvakrát premyté Hankovým roztokom, naplnené 100mkl elúciou roztoku (0,1 M NaH2PO4: C2H5OH - 1: 1) iinkubiruyut pri teplote miestnosti po dobu 15 minút. Pri nepreryvnomperemeshivanii. Meranie absorbancie pri elúciu na fotometra rastvoraprovodyat "EFOS 9305" pri vlnovej dĺžke 620 nm.6. Evaluation of potravinárskych výrobkov, poluchennoyiz geneticky modifikované zdroje funkčného - technologické svoystvam6.1. Potreba výskumným porazdelu 6 je stanovená znalcom v Moskve gosudarstvennogouniversiteta aplikovanej biotechnológie Ministerstva školstva, mládeže a ruský generál iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Životnosť ľudského organizmaglavenstvuyuschuyu proteínov hrá úlohu, takže sa zdá vazhnymprosledit, v prípade, že nepodlieha žiadnej zmene modifikáciou protsessegeneticheskoy ako mozhetprivesti genetického inžinierstva zmeniť štruktúru a funkciu proteínov, proteínov chastnostifermentov.Svoystva jednoznačne spojený s jeho štruktúrou. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza jeho kryštálov. Avšak, pre väčšinu proteínov používaných v nutričných údajoch na ich strukturepo niekoľkých neznámych dôvodov. Na druhej strane je známe, chtostruktura proteíny tiež určuje ich termodynamickej vlastnosti, ktoré zase ovplyvňujú ich funkčné číslo svoystva.Suschestvuet metódy merania termodynamickej vlastnosti, z ktorých výhodný spôsob je kalorimetria. Etotmetod umožňuje merať teplotnú závislosť teploemkosti.Iz ​​získa závislosť možno vypočítať dlyanativnoy tepelná kapacita a denaturovanej formy proteínu, a proteín temperaturudenaturatsii entalpiu. Vypočítaná termodynamická parametrypozvolyayut definujú integrálne hydrofóbnosť a konformatsionnuyustabilnost proteíny [38 - 40]. Tieto charakteristiky tesnosvyazany so základnými funkčnými vlastnosťami [41 - 44] .Metóda iónové párovanie HPLC vobraschennyh fázy umožňuje identifikačné jednotku zamenyaminokislotnyh zvyšky v makromolekuly proteínu a nevyhnutných prisravnitelnom štúdie proteínov [44] .V procesu zmeny genómu organizmu v ňom nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost faktory vneshnimneblagopriyatnym - choroby, hmyz - škodcovia herbicíd, atď. V určitých koncentráciách, to komponentymogut byť nebezpečné pre ľudské zdravie, je používaný v pischuprodukty vyrobené s použitím genetických metód inzhenerii.Poetomu pri priemyselnom spracovaní surovín, mogutpotrebovatsya zmeny existujúcich technológií, obespechivayuschieminimalnoe zvyškové opasnyhdlyazdorovyakomponentov. Tieto zmeny v technológii môže ovplyvniť nakachestvennyh ukazovatele (funkčne -tehnologicheskihsvoystvah) proteínové prípravky vyrobené z tejto geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe zmeniť zloženie aminokyselín proteínov extrahovaných z geneticky modifikovaných potravinárskych výrobkov (napr., Ktoré majú vyváženú ACN), k zvýšeniu ich pischevoytsennosti. To nevyhnutne za následok zmeny vo funkčných vlastnostiach komerčných -TECHNOLOCKÝ proteínových preparátov iotrazitsya kvality potravín, v ktorých oniispolzuyutsya. To potom môže viesť k zmenám v neobhodimostivneseniya procesov pomocou etipreparaty. Z tohto dôvodu, kontinuálne kontrola (kontrola) vlastnosti proteínových prípravkov vyrobených z potravinárskej suroviny, keď geneticheskimodifitsirovannogo iste bezopasnomsoderzhanii komponenty škodlivé cheloveka.Mikro- proteín a makro-molekuly určuje ryadnaibolee dôležité funkčné vlastnosti proteínu, také kakrastvorimost, schopnosť stabilizovať emulzie a peny gély forma udržať mastnoty a vlhkosti [9 - 13] .Tieto funkčné vlastnosti sú priamo spojené s skharakteristikami hotové potravinárske výrobky. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | funkčné vlastnosti | Vplyv na vlastnosti hotového || | Produkt | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | pH vodnej suspenzie | charakteristický proteín preparatov- || | Definuje základné možnosť || | Použitie lieku bielkovín v || | Určitý typ výrobku | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Rozpustnosť | slúži ako primárny pokaza- || | Tell kvalitných bielkovín preparatov- || | Príčiny reologických vlastností || | Proteín obsahujúci potravinových systémov, udržateľné || | Ness emulzia stabilizovanej s Belgorod || | Com zhirouderzhivayuschuyu schopnosť belko- || | O prípravky | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | Reologické vlastnosti | stanovenie úrovne podaní lieku || vodných disperziou | produkt, ktorý poskytuje požadované || | Komplexné reologické vlastnosti hotového || | Výrobok má vplyv hmotnej || | Prúdy v procese | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | zadržiavanie vody a | ovplyvňujú úroveň zavedenia produktu || zhirouderzhivayuschaya | proteínové prípravky poskytujúce || kapacity | zníženie strát v procese || | Spracované (varené a vyprážané), jednotný || | Súlad výrobkov, zníženie manželstvo || | Výsledok oddelenia vody a tuku, || | Produkty redukcie Volume | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Kritická koncentrácia | určuje úroveň zavedenia výrobku || ce gél | proteínové prípravky poskytujúce || | Povinné komplexné štrukturálne - mechanický || | Vlastnosti iCal hotového výrobku | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | emulzia | určuje úroveň zavedenia stability produktu || | proteínové prípravky poskytujúce || | Príprava stabilných tukových emulzií, || | Zabraňuje oddelenie tuku v procese || | Spracovanie | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + v súčasnosti žiaden štandardizovaný metodyopredeleniya funkčných vlastností a výsledky meraní dolzhnynosit porovnávacej charakter v súvislosti s liekmi ilikommercheskim výrobkov vyrobených z nemodifitsirovannogopischevogo syrya.Osnovnye metód pre určenie funkčné vlastnosti preparatovprivedeny v nasledujúcej tabuľke. -------------------------- + ---------------- + -------- + ------------ + | index | Metóda stanovenia | Literárne || || source | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + 1 | 2 | 3 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | prostriedok identifikácie | histologické metódy | 51 || produkty ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | rozpustnosť | spektrofotometer | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | zadržiavanie vody | metóda odstreďovania | 46 || schopnosť ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | stabilita emulzie | metóda odstreďovania | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | Kritická koncentrácia | termotropní metóda | 48 || gél | gél + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC b- | metóda odstreďovania | 49 || Nosta ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | konformační | mikrokalorimetrie | 38-40 || stability ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | Identifikácia amino | iónové párovanie HPLC metódou | 45 || zvyšky ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | termodynamické vlastnosti | diferenčné metóda | 39 || | Skenovanie microcalorimeters ||| | Kalorimeter || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Integral hydrofobicita | mikrokalorimetrie | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | Reologické vlastnosti | Viskozimetrická | 52 || vodnej disperzie ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | aminokyselinová kompozície | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | organoleptické vlastnosti | kvalimetrie | 53 || tuk: farba, vôňa, priehľadnosť |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | index lomu | Refraktometria | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | tuk hmotnosť | denzitometria, | 53 || | Gravimetria || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | viskozita tuky | Viskozimetrická | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | mastných - kyselina zloženie | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | počet Jód | volumetrie | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | kyslosti | volumetrie | 53 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | číslo zmydelnenia | volumetrii | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | želatinační teplota | Viskozimetrická | 54 | | škrob ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | veľkosť škrobových zŕn | Optická mikroskopia | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | retencia vody | Gravity | 54 || schopnosť škrob ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | Reologické vlastnosti | Viskozimetrická | 54 || vodnej disperzie škrobu ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | napúčanie škrobu | Optická mikroskopia | 54 || zrná ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | Kritická koncentrácia | metódy Thermotropic | 54 || želírovacie škrob | želírovací || + -------------------------- + -------------- ---------- + ------------ + | amylózy obsah a | spektrofotometer | 54 || amylopektín ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. ma 
Delež v družabnih omrežjih: 

 
Podobno
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.
» » » Zdravotnícke právo: právo, dokumenty, úlohy, pravidlá, akty.