Metódy pre laboratórnej diagnostiky chlamýdiovej infekcie v čeľustnej zápal prínosových dutín

Video: otolaryngology Ponidelko SN (SM Clinic)

I. Tsitoskopichesky spôsob detekcie Chlamydia

Navrhla dve metódy, ktoré môžu byť rozdelené do invazívne a neinvazívne. Podstata Prvý z nich je, že materiál pre túto štúdiu je obsah čeľustných dutín, čo má za následok vpichu ihly Kulikovskii ktorý po odstredení bol použitý na prípravu šmuhy.

Druhá metóda je nasledujúci: po nosovej anemizatsii 0,1% epinefrín riešenia a aplikácie anestézii strednej oblasti nosovej priechod dikaina 3% roztok - 0,3 ml, s použitím špeciálnych jedno kefy vykonávané plot materiál pri otočných pohyboch medzi 10-15 mediálne povrch stredného Skořepa a laterálnej nosovej steny v oblasti vedľajších nosných dutín anastomózy. Takto získaný materiál sa rovnomerne na podložné sklíčko, na vzduchu sa vysuší a fixované v acetóne po dobu 10 minút pri teplote 4-6 ° C, Pripravené tampóny môžu byť uložené až do štúdie po dobu 2 týždňov. pri teplote 2-6 ° C,

Maľovanie na Romanovský-Giemsa. Ex tempore farbivo sa zriedi destilovanou vodou 1:10. Sklíčka sa umiestni do Petriho misky na drevených palíc drog nadol. Priestor medzi mŕtvice a spodnej časti pohára je naplnený farbivom. Farbenie sa vykonáva po dobu 45 minút. Potom sa sklo dôkladne premyje tečúcou vodou, vysušia sa filtračný papier a diferenciáciu v okyslenom alkohole (100 ml 96% etanolu sa pridá 10 kvapiek ľadovej kyseliny octovej). Po farbení prípravky sú pri pohľade v svetelnom mikroskope s použitím ponorného šošovky (X90). V tomto prípade sa bunky cytoplazmy sfarbené modro, jadra - v fialovo-modrým cytoplazmatickej inklúzie chlamýdie sú určené ako tmavo modré alebo ružové mikrokolonií na pozadí modrej cytoplazmy. V kroku elementárne telieska Chlamydia inklúzií sfarbené ružové krok východiskových buniek modro (Ponidelko SN, 2001). Pre zvýšenie obsahu informácie o spôsobe morfologických štúdií uskutočnených v počítanie počtu neutrofilov, lymfocytov a makrofágov v náteroch pripravených pred ošetrením a dynamiky pod vplyvom podávaných liekov.

II. Metóda DFA

Škvrny pripravené z soskobnyh materiálov, rovnako ako krvné nátery farbené zmesou prijatého v pracovných riedeniach normálny imunoglobulín fluorescenčné chlamýdiových a hovädzieho albumínu, označených rodamínové na kontrastné pozadie. Pomocou pracovné riedenie séra 1 / 20-1 / 40. Sklíčka sa skúšobného materiálu a umiestnené farbivo sa umiestni do vlhkej komory v termostate po dobu 30 minút, načo sa sklo sa odstráni a premyje extenzívne vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (pH 7,2) za miešania magnetickým miešadlom po dobu 1 hodiny, zmena pufru po 30 minút. Na sušených náteroch použitá jedna kvapka pufra s glycerolom (9 ml glycerolu a 1 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku), a potom sa na ne vzťahujú s krycím sklom (Ponidelko SN, 2001). Prípravy sú prezeranie pod fluorescenčným mikroskopom "Luma-OUT". Analýza ziskovosti sa vykonáva vizuálne. Získané výsledky sú považované za pozitívne, pokiaľ je v prípravku zistené morfologicky typické chlamýdií prvky špecifické fluorescenčné smaragdovo zelené alebo žltozelené:

Chlamydia retikulocyty (PT) a klastra chlamýdie v cytoplazme vo forme mikrokolonií, ktoré majú podobu kompaktné, difúzne farbených útvary rôznych veľkostí - od 0,25 do 1,5 mikrometrov;
Chlamydia elementárne telieska (EBS), - tvorba, ktoré sú predovšetkým u buniek, guľovité alebo vajcovitého tvaru s výrazným farebným obvodového lemu vo forme uzavretého kruhu, alebo semiring veľkosť 0,25-0,5 mm;
intercellularly nachádza inklúzie - veľké jasne zelené škvrny vytvorené sú blízko pri sebe ET.

III. sérologické metódy

objem krvi v 2,5-3,0 ml v nalačno odobratých z lakťovej žily do suchej centrifugačnej skúmavky. Trubica s krvou, aby sa lepšie zrazeniny zaťahovanie krviniek inkubujú pri teplote 37 ° C počas 40-45 minút. Po inkubácii skúmavka sa odstreďuje 20 minút pri 3000 ot. / Min zrazenina "obkľúčiť", a skúmavka sa umiestni na 1 hodinu do chladničky a potom, za použitia Pasteurovej pipety, sérum bolo oddelené od zrazeniny. Séra boli transportované do laboratória, v najbližších 1,5-2 hodín alebo skladované pri 4-6 ° C počas 1-3 dní. Jednotlivé vzorky séra obsahujú prípustné v mrazničke chladničky pri teplote mínus 20 až 40 ° C až do sériovej štúdií obdobia, ktoré nie je dlhšie ako 6 mesiacov.

Najkonkrétnejšie a informatívne (90%), je považovaný za reakcia nepriamu imonufluoreskujúca (RNIF). Detekcia protilátok proti chlamýdie iba jedna vzorka séra, aj keď ich výkon titer 1 / 8-1 / 16 môže znamenať pravdepodobnosť prúdu ako chlamýdiovou infekciu a prítomnosť stopového reakcie súvisiace s akoukoľvek chlamýdiovej ochorenia etiológie migrované posledný. Zvýšenie chlamýdiovej titre protilátok 1 / 64-1 / 256 a dokonca ešte vyššia v jednej vzorke séra na aktuálne dlhých a zložitých foriem infekcie odráža nahromadenie limit mikroorganizmus humorálna odpoveď a zodpovedajúce výsledky klinickej a epidemiologické analýzy a anamnestických údajov nadobúdajúci diagnostickú hodnotu.

Nepriama imunofluorescencia technika umožňuje identifikáciu Chlamydia tvoriť s vhodnými testovaných objektov a titrácie séra s ohľadom na špecifické typy látok, tiež umožňuje vyhodnotiť obsah séra jednotlivých tried imunoglobulínov v prítomnosti komerčné fluorescenčné Ig M, A, G. negatívne výsledky sérologických testov nevylučuje prítomnosť akútne alebo chronické (trvalé) chlamýdiovou infekcii (Ponidelko SN, 2001).

Použitie RNIF maxilární sinusitída u pacientov určenie titra Chlamydia protilátok v sére. Ako sa používa antigénne prípravky pripravené na náteroch ohraničený sklíčok mikrobiálnych suspenzií pevných po dobu 30 minút so studeným acetónom. Materiál pre steru suspenzie sú zmesou žĺtkového vaku z kuracích embryí alebo orgánov bielych myší infikovaných C. trachomatis, C. pneumoniae a C. psittaci.

Tieto antigénne prostriedky, ktoré majú špecifickosť k úrovni rodu, poskytujú identifikáciu Chlamydia protilátok (AT) epidemiologicky významných pre všetky typy chlamýdie. Test sérum v riedení 1: 2 až 1: 256 sa aplikuje na tampóny, skla, umiestni do vlhkej komory a inkubuje sa pri teplote 37 ° C po dobu 15-20 min. Po expozícii sa skúšobný materiál sa premyje vodou z vodovodu a potom sa sklo ponorí do šálky batéria s fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom s pH 7,2-7,4, a potom sa opláchne destilovanou vodou. Po vysušení pri teplote miestnosti, čím sa spôsobí šmuhy prijaté na pracovnom riedenie králičieho anti-ľudského imunoglobulínu luminiscenčné a umiestnenie skla vo vlhkej komore, inkubujú sa pri teplote 37 ° C po dobu 15-20 min. farbenie zmes sa potom odstráni, sklo sa premyje fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom pH 7,2-7,4 po dobu 10 minút, premyje sa destilovanou vodou a vysušia sa na vzduchu.

Mikroskopia farbených prípravkov vykonáva pomocou fluorescenčného mikroskopu. Intenzita fluorescencie špecifické v formuláciách bola vyhodnotená konvenčnou chetyrehkrestovoy stupnice (Ponidelko SN, 2001):

"++++" - jasne fluorescenčné zelenkavá okolo EBS jasne viditeľných svetelných "ráfiky";

"+++" - dostatočne jasné fluorescenčné žlto-zelenej farby, je možné detekovať periférne "ráfiky" v ET;

"++" - slabá fluorescencia, patogén morfologicky ukázalo úplne jasne, ale periférne "ráfiky" v ET sotva znateľné;

"+" - slabá fluorescencia, farebné nedefinované morfológia mikroskopia objekt rozpoznateľný zlé.

Pre diagnosticky-významný titer anti-Chlamydia protilátky sa maximálna riedenie séra, ktorý poskytuje špecifický obraz, ktorá nie je nižšia ako "++". Pri hodnotení sera sérologickú aktivitu proti chlamýdiovej antigény pre príjem diagnosticky významné titre 1: 8 a vyššie.

IV. Metóda polymerázovej reťazovej reakcie

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola prvýkrát popísaná v roku 1985 a stal sa štandardná metóda amplifikácie DNA v mnohých laboratóriách molekulárnej biológie. Základom techniky oligonukleotidov namierených opakujúce sa cykly syntézy DNA, čo vedie k replikáciu in vitro cieľovej nukleotidovej sekvencie. V dôsledku toho môže dôjsť k zosilneniu 1 miliardu kópií cieľovej DNA, ktoré môžu byť detekované buď gélovou elektroforézou alebo hybridizáciou so špecifickou sondou, nasleduje detekcia hybridov testom ELISA (ELISA). PCR má vysokú druhovú špecifickosť a citlivosť na 10 molekúl DNA (Ponidelko SN, 2001).

Po odobratí materiálu v súlade s vyššie uvedenými postupmi s použitím špeciálnych kief na jedno použitie sa umiestni do sterilných skúmaviek, 2 ml (epindorfy) vopred pripravený v pufri (0,9% roztok chloridu sodného). Materiál po dobu 2 hodín a dopravené do laboratória po zmrazení na teplotu -18 ° C sa udržuje po dlhú dobu pred štúdií.

Výsledok analýzy sa považuje za pozitívny, ak:

Veľkosť DNA produkt v klinickej vzorke, presne zodpovedá DNA produktu z kontrolnej vzorky;
vo vzorke, ktorý obsahuje vzorky a vnútorný štandard, je identifikovaný špecifickým DNA produktu vnútorného štandardu;
vo vzorke, ktorý obsahuje vodu (negatívna kontrola) namiesto klinickej vzorky DNA produkt detekovaný.

Výsledok analýzy sa považuje za negatívny, ak:

vo vzorke, ktorý obsahuje klinická vzorka, špecifických produktov DNA nemôže byť detekované;
PCR za následok oboch kontrolných vzoriek špecifické produkty DNA nerozpoznáva.

Analýza bola opakovaná, ak:

vo vzorke, ktorý obsahuje kontrolné DNA, produkty DNA špecifické nemôžu byť detekované;
vo vzorke s DNA produktmi vnútorných štandardov špecifických nemôžu byť detekované, a detekovať špecifické DNA produktu v negatívnej kontrole.

V. kultivačná metóda pre izoláciu chlamýdií

Izolácia patogénu v bunkových kultúrach (cm), vopred ošetrené rôznymi antimetabolity, je jedným z najlepších metód pre chlamýdie diagnózu, takzvané "zlatý štandard".

Materiál je prijatá ako metóda DFA (PIF), sterilných špeciálnych kief. Prijatá materiál je umiestnený v dopravnom médiu. Vzhľadom k tomu, transportné médium je fosfátový pufer s sacharózy, ku ktorej je pred použitím tepelne inaktivovaného hovädzieho séra pridá pri teplote 4% z celkového počtu, streptomycín 50 ug / ml amfotericínu B 25 mg / ml média. Dodávky materiálu v laboratóriu sa vykonáva (v termoske s ľadom) najneskôr za 2 hodiny po odbere vzoriek. Kultúry vykonáva za použitia bunkovej kultúry LLC + MR2 + L929 + BHK-21C umelo nízky odpor. Vyzdvihnutie materiál je laminovaný na monovrstvách bunkových kultúrach, pestovaných na krycie sklíčka, predtým vypustený rastové médium. Potom, infikované bunkové kultúry sa umiestni do fľaštičiek a centrifúguje po dobu 1 h pri 3000 ot. / Min, čo zvyšuje počet intracelulárnych inklúzií. Po odstredení sa materiál nalial do vialiek, pridať izolačné médium "ihly» (Eaglas MEM) s tsiklogeksamidom v koncentrácii 2 mg / ml. Skúmavky boli inkubované v termostate pri 37 ° C počas 48-72 hodín (zodpovedá dobe cyklu chlamýdie), načo sa krycie sklíčka boli odstránené z monovrstvy s rúrkami, ktoré na sklenené sklíčka sa monovrstva v kanadskom balzamu a stanovenie začlenenie patogén. Predtým, fixáciu a farbenie sa vykonáva šmuhy flyuorestsiiruyuschimi protilátok a výsledky hodnotené po 48-72 hodinách PIF (s použitím špecifických polyklonálnych a monoklonálnych protilátok). Po obdržaní negatívnych výsledkov produkovať nové semeno (priechod) materiálu. Infekcie bunkovej monovrstvy a vyhodnotenie výsledkov sa vykoná štandardnými metódami.

Spôsob diagnostického prideľovanie chlamýdií v bunkovej kultúre sa musí používať po celú dobu ochorenia, s výnimkou obdobia antibiotickej liečby a po dobu 2-3 mesiacov. po nej. Pre kontrolu lieku za účelom identifikácie životaschopné chlamýdie, ktoré môžu vykonávať svoj celý životný cyklus, táto metóda sa používa po 3 mesiacoch. po ukončení liečby.

VI. Spôsob elektrónová mikroskopia

Za účelom vytvorenia diagnostického pretrvávajúca chlamýdiovej infekcie v čeľustnej spôsobom zápal prínosových dutín za použitia elektrónovej mikroskopie. Štúdia bioptických nosovej sliznice a dutiny. Za týmto účelom, slizničnej časti ihneď po plota sú fixované v 2,5% glutaraldehydu teho 0,1 molárnu kakodylátovém pufri pri pH 7,4 po dobu 2-24 hodín. Po premytí trikrát v kakodylátovém pufri dofiksiruyutsya 1% roztok oxidu osmičelého na 1,5-2 hodiny. dehydratácia sa uskutočňuje v alkoholoch s rastúcou koncentráciou liečiva po dobu 15-20 minút a impregnačné živice v zmesi s Epona aralditom. Na záver sa polymerizácie vykonáva v inkubátore po dobu 3 dní. pri 37 ° C a 60 ° C, Po polymerizácie semithin rezy boli pripravené 1 mikrón hustá ultratome LKB-3 (Švédsko). Farbené rezy sa vykonáva podľa metódy navrhnuté C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), metylénová modrá, azúrová 2 a základná fuchsínu pre prehliadanie a analýzu pomocou svetelnej mikroskopie (Ponidelko SN, 2001). Súčasne možno fotografovať pomocou photomicroscope «Opton» (Nemecko). Potom sa pripraví ultratenké rezy 3700 angströmov silné, je umiestnený na ich veľkosti medi ôk medzi 200 a potom porovnaný s nasýteným 30% roztoku etanolu a citrátom olovnatým (Reynolds). Rezy boli skúmané pod elektrónovým mikroskopom JEM «100S» (Japonsko) pri urýchľovacím napätí 80 kV, s nárastom x5, x10, x50 X30, tisíckrát. Foto použitý typ filmu FT-41P (Rusko).

Na diagnostiku chlamýdiových lézií vedľajších nosových dutín, je potrebné použiť špeciálny diagnostického algoritmu.

Základným princípom diagnostického vyhľadávanie je jeho trojstupňová.

V prvej fáze skríningovej štúdie sére pacientov s sinusitídy pre detekciu Chlamydia protilátok indikujúcich prebiehajúce infekcie ELISA a RNIF a overovanie chlamýdiových druhov (C. pneumoniae, C. trachomatis, C.psittaci).

V druhom stupni sa pomocou PIF a PCR sa vykonáva priamo v diagnostike chlamýdií ložísk (nosovej dutiny a prínosových dutín) a leukocytov z periférnej krvi na stanovenie generalizovanej infekcie.

V tretej fáze diagnózy pomocou CM určiť Citlivosť na antibiotiká činidlá.

Tento algoritmus bol testovaný v prieskume 97 pacientov, vrátane tých s chronickou maxilární sinusitídy predstavovali 28 osôb, 39 boli pacienti s rekurentnou akútnou maxilární sinusitídy a 30 - netrpia chorobami horných ciest dýchacích a vstúpil do kontrolnej skupiny. Porovnávacie spravodajskej hodnoty rôzne laboratórne metódy pre diagnózu chlamýdiovej infekcie medzi skupinami sledovaných údajov uvedených v tabuľke.

Porovnávacie spravodajskej hodnoty rôzne laboratórne metódy pre diagnózu chlamýdiovej infekcie u zápale prínosových dutín

metóda	chlamýdiovej infekcie
metóda	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	iba
podielový fond	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

Ako je zrejmé z údajov uvedených v materiáli od pacientov s diagnózou anti-chlamýdiových protilátok chlamýdie polyklonálne skupiny pre konkrétny 59 (60,7%) pacientov. Avšak, použitie iných diagnostických techník nechá za celú dobu ich identifikácii. Pokiaľ je nastavené približne rovná frekvencii detekcie S. pneumoniae a pacientov s infekciou C. trachomatis v materiáloch zápal prínosových dutín (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

To znamená, že výsledky porovnávacej štúdie metód pre diagnostiku chlamýdiovej infekcie ukázalo vysokú frekvenciu detekciu Chlamydia s maxilární sinusitídy, ktorý umožňuje definíciu "Chlamydia etiológie zápale prínosových dutín" a identifikovať celý rad klinických prejavov, charakteristika tejto skupiny ochorení.

"Ochorenie, poranenia a nádor maxilofaciálnu"
ed. AK Iordanishvili

Delež v družabnih omrežjih:

Podobno