Transgénne zvieratá: technológie

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - Transgénne zvieratá a porovnávacej embryológie

Na rozdiel od rastlín, kde je možnosť získania fertilné rastliny z transformovanej somatických buniek a klonovanie, produkcia transgénnych zvierat - veľmi ťažké a zdĺhavé.

Stratégia použitá je nasledujúci:
1. Klonovaný gén sa zavedie do oplodneného vajíčka jadra.
2. oplodneného vajíčka s exogénny DNA sa implantujú do recipientní samice (od úspešného dokončenia cicavčieho embrya za iných okolností nemožné).
3. Odvzdušňovacia potomstvo vyvinula z implantovaných vajec, ktoré obsahujú klonovaného génu vo všetkých bunkách.
4. skosenie zvieratá, ktoré nesú klonovaného génu v bunkách zárodočnej línie a poskytujú novú genetickú líniu.

Experimenty na geneticky modifikovaných mnohobunkových organizmov od zavedenia transgénov do nich vyžadujú veľa času. Avšak, transgénne stať mocným nástrojom pre štúdium molekulárnej bázou cicavcov génovej expresie a vývoja, vytvorenie modelovej systémy, umožňuje štúdium ľudských ochorení, ako aj genetickú modifikáciu mliečnych žľazách živočíšnych buniek za vzniku mliečne proteíny, ktoré sú dôležité pre medicínu. Došlo aj nový termín "pharming» (pharming), s odkazom na procese prípravy mlieka transgénnych zvierat autentickej ľudskej proteíny alebo liečiv.

Použitie mlieka je výhodné preto, že je vytvorený v tele zvieraťa v veľkom počte a môžu nadaivat ako potrebná bez poškodenia zvieraťa. Produkoval mliečnej žľazy a vylučuje do mlieka nie je nové bielkoviny musí teda pôsobiť nežiaduce účinky na normálnych fyziologických procesov u transgénnych zvierat, a podrobené post-translačný zmeny, ktorá je aspoň v blízkosti tých, v ľudských bunkách. Okrem toho sú jeho izolácie z mlieka, ktorá obsahuje iné proteíny, nesmie byť príliš ťažké.

Napriek tomu, že sa prvé transgénne zviera boli získané v roku 1985 zavedenie exogénne DNA do pronukleární zygoty doteraz vyvinutý účinný spôsob, ktorý by mohol byť použitý pre vytvorenie geneticky modifikovaných zvierat, bez ohľadu na typ a účelu experimentu. Vývoj nových účinných metód prenosu génu do embryonálnych a somatických buniek zvierat, ako aj zlepšenie existujúcich postupov je naliehavou úlohou.

Medzi veľkým množstvom spôsobov zavedenie exogénne DNA do genómu zvierat možno rozlíšiť, ktoré sú široko používané v praxi transgénových:
- metóda mikroinjekcie,
- retrovírusom sprostredkovaný prenos génu,
- modifitsirovanngh využitie embryonálnych kmeňových buniek,
- Prevod transformovaných jadier generatívnych a somatických buniek
- Použitie spermií a spermatogónií ako vektory DNA.

Medzi ďalšie spôsoby dodávania exogénny DNA do organizmu zvierat, možno poznamenať, použitie lipozómov, adenovirových vektorov, rovnako ako vstrekovacie metódy vysokorýchlostného. Avšak, tieto metódy nie sú široko používané vzhľadom k ich nedostatočnej stability a nedostatok integrácie transgénu do genómu.

Mikroinjekcie rekombinantnej DNA do oplodnených oocytov mnohobunkových živočíchov sú stále najpopulárnejší spôsob, ako zaviesť cudzorodých génov do zvierat. Napriek skutočnosti, že táto metóda vyžaduje vysokú zručnosť a drahé vybavenie, jednoduchosť a spoľahlivosť platia všetky jeho nedostatky.

Prvý a dobre zavedený experimentálnu systém pre produkciu transgénnych zvierat bola myš. Darca samica myší s experimentálnym superovuláciu krížil sa samce z výroby, po 12 hodinách bol izolovaný oplodnené vajíčka a umiestnené v kultúre. Ďalej, väčšia z dvoch pronukleů (zvyčajne muži) bola injikovať rekombinantnej DNA (obr. 2.17). Survivors injekčne vajcia je transplantované do recipientní samice. Len pokračoval časť transplantovaných oocytov vyvinúť až do pôrodu.

Obr. 2.17. Mikroinjekcie exogénne DNA do pronukleu oplodneného vajíčka cicavcov pod mikroskopom (a) a experimentálne nastavenia (B)

Frekvencia integrácia exogénne DNA za použitia metódy mikroinjekcie je ovplyvnený takými faktormi, ako je čistota injekcie vzorky, tvaru a koncentrácia DNA, zloženie roztoku pufra pre mikroinjekcie, kvalita embryí, a spôsob príjemca prenosu embrya (nechirurgická, chirurgické, laparoskopické).

Transgénne zvieratá sú identifikované v potomstve rôznymi spôsobmi, väčšina z PCR a spojený so získanie transgénnych línií. Niektoré z transgénnych zvierat sú mozaiky (zárodočné bunky neobsahujú exogénny DNA) krížením transgénnej je teda menšia časť prvej generácii potomkov ako vypočítaná 50%. V niektorých prípadoch, homozygotná línia nemožno získať, pretože transgénnych inzertov 5-15% homozygotných smrteľné, pretože vloženie niekedy porušuje životne dôležité časti genómu.

Presný mechanizmus pre integráciu injektovaného DNA do chromozómov cieľových buniek nie je známa, ale analýza DNA vloženej štruktúry odhaľuje niektoré body. Integrácia dochádza náhodne na jednom chromozómové lokuse, ktorý môže obsahovať jeden až niekoľko tisíc tandemových kópií integrovanej DNA. Približne 30% z primárnych transgénnych zvierat získaných zvyčajne vykazujú určitý stupeň mozaiky, ktoré môžu vyplynúť z integrácie replikácie exogénny DNA po prvom cykle.

Stupeň integrácie exogénne DNA do genómu, tj., počet transgénnych zvierat z celkového počtu narodených zvierat s využitím metódy mikroinjekcie, v závislosti od druhu mení na malý rozsah 5-15%. Najdôležitejšie vzhľadom na náklady potrebné na výrobu jedného transgénneho zvieraťa je transgénne celkový index účinnosti, ktorý sa vypočíta ako pomer získaného transgénneho zvieraťa z celkového počtu transplantovaných embryí, vyjadrený v percentách. Hodnota tohto indexu pre cicavce je tiež relatívne konštantný v priemere o ~ 0,5% pre ošípané a kravy do asi 2% u myší.

Retrovirusove vektory sa tiež používajú na generovanie transgénnych zvierat. Infekcia preimplantačných embryí s rekombinantnej retrovírusy - relatívne jednoduché a účinné riadenie.

Vosmikletochnuyu morula (obr. 2.18) uvoľní z vaječnej škrupiny a umiestni sa do kultivačnej misky s fibroblasty produkujú rekombinantný retrovírus. Infikované embryá do štádia blastula boli implantované do falošne samíc. V dôsledku toho, transgénne organizmy sú generované, mozaiky v závislosti na počte a umiestnení Vstavby rekombinantnej DNA do genómu. Z tohto dôvodu, aby sa získal čistý riadky ďalej vyžaduje rozsiahle outbreeding.

Nevýhodou tohto spôsobu je obmedziť vloženie exogénny DNA ~ 8 spotrebného tovaru, pričom transgén môže byť bez susedných regulačných sekvencií nutných pre jeho expresiu, a v niektorých prípadoch, integrovať do pôvodného lokusu nestabilné.

Nové lentivirové vektory (lentiviry patrí do rodiny retrovírusov), preukázali svoju veľmi vysokú účinnosť pri poskytovaní DNA do oocytov a zygoty. Injekcia rekombinantný lentivirové konštruktov do perivitelline priestoru prasacích zygoty a hovädzích oocytov za následok vzhľadu potomstva s najvyššou súčasnej dobe lalokov transgénnych zvierat. V rovnakej dobe, lentivirové vektory majú všetky nevýhody retrovirusove: malej veľkosti vloženie exogénny DNA a roztrúsenej integrácie do hostiteľského genómu, čo môže viesť k nežiaducim vedľajším účinkom, ako je aktivácia onkogénov a inzerční mutagenéza. Okrem toho, lentivirové vektory pre vysoký stupeň mozaiky transgénneho potomstva vyrába a jednotlivé skutočnosti neumlčuje (inaktiváciu) rekombinantný lentivirové sekvencie získané transgénne línie.

Použitie retrovírusových vektorov má jednu veľkú nevýhodu. Aj keď sú tieto vektory sú vytvorené tak, že sú replikačná defektné retrovírus kmeň genóm (helper vírus), ktorý je nevyhnutný pre získanie veľkého množstva DNA vektora môžu spadať do rovnakej jadro ako transgénu. Cez všetky opatrenia, retrovírusy pomocníci môžu byť replikované v transgénnym zvierati, čo je absolútne neprijateľné, ak tieto zvieratá, ktoré majú byť použité ako potraviny alebo ako nástroj na získanie komerčného produktu. A pretože existujú alternatívne metódy transgeneze, retrovirusove vektory sú zriedka použité pre generovanie transgénnych zvierat, ktoré majú komerčnú hodnotu.

Obr. 2.18. Schéma pre získanie línie transgénnych myší s použitím retrovírusových vektorov

Modifikované embryonálne kmeňové bunky môžu byť použité na získanie transgénnych zvierat. Bunky izolované z myších embryí v štádiu blastocysty, môžu proliferovať v kultúre, pri zachovaní schopnosti diferencovať sa všetky typy buniek, vrátane buniek zárodočnej línie, pri podávaní v inom embryá do štádiu blastocysty (obr. 2.19).

Tieto bunky sa nazývajú pluripotentné embryonálne kmeňové bunky (ES). ES-bunky v kultúre môžu zaviesť transgénu cieľové rôzne techniky (transfekcia, elektroporácie, retrovirusove infekcie, atď.), Bez narušenie ich pluripotence. Praktickou výhodou tohto systému je, že poskytuje veľkú príležitosť pre výber buniek určitého parametra. To môže byť počet kópií transgénu, jeho lokalizácia alebo expresných vzorov.

Znalosť sekvencie obklopujúce špecifické miesto pre požadovanú integráciu možno skonštruovať vektor pre vloženie cieľovej DNA pomocou homológnej rekombinácie. Napríklad nahradiť gén kódujúci ľahko identifikovateľné indikáciu na účely výberu odstránením jeho alebo obnovenie funkcie vo výslednom transgénne bunky.

Rovnakým spôsobom, tzv knockout myší (knock out) - myši s inaktivovaným smerovo špecifické bunkového génu pre štúdium jeho funkciu. Na vykonanie homologické rekombinantný vektor je konštruovaný z fragmentov cieľového génu, ktorá je naplánovaná na inaktiváciu časť cieľového génu sa potom nahradí selekčný marker pre selekciu buniek, s integrovaným dizajnom.

Obr. 2.19. Príprava transgénnych myší rekonštrukciou embryí za použitia geneticky modifikovaných embryonálne kmeňové bunky (ES-buniek). ES-bunky sú odvodené z vnútornej bunkovej hmoty myšou blastocysty

Vybrané transgénnej ES-bunky môžu byť kultivované a použité pre produkciu transgénnych zvierat. Tým sa zabráni nechcenému vloženie transgénu, ktorý je charakteristický pre metódu a mikroinjekcie retrovírusových vektorových systémov.

Všetky získané v rámci systému mozaiky zvierat je tak nutné chovateľskej práce na získanie čistých línií. Primárne problém mozaiky transgénne zvieratá môžu byť prekonané presadení jadra transformovaných ES-buniek do enukleovaných oocytov, ktoré boli potom pokračoval v ich normálny vývoj. Výsledkom je, že v každej bunke živočícha získané obsahuje transgén.

Bohužiaľ, pluripotentné ES bunky, podobne ako u myší, kým sa nachádzajú v iných cicavcov a vtákov, ale hľadanie pokračuje.

Prenosu jadra transformovaných generatívne a somatické bunky do vajíčka, alebo somatické nukleárna prevod (somatické prenos nukleárny), iná metóda používa v praxi transgeneze. Bolo ukázané, že jadro embryonálnych buniek rôznych zvierat, keď je prenesený do enukleovaného vajíčka niekedy schopný zabezpečiť vývoj nového organizmu. Po krátkej kultiváciu aj jadro niektoré z diferencovaných buniek, sú schopné zabezpečiť rozvoj životaschopného jedinca.

Napríklad známa ovca Dolly bol klonovaný v roku 1997 z fúzie kultivované (3-6 priechody) epitelových buniek (vemeno) dospelé zviera so šiestimi rok nemajú vajíčka jadra (obr. 2.20). Aj keď nemožno vylúčiť možnosť, že klonovanie bolo omylom užili nediferencovanej bunky prítomné v donorové epitelu.

Obr. 2.20. Klonovanie oviec prenosom jadra. Epitelových buniek v kultúre je indukovaná pre vstup do fázy G0 (stupeň, na ktorom vajcia). Potom sa fúzia týchto buniek s enukleovaného oocytu a embryá sa pestujú až do skorých štádiách embryogenézy. Načo sa embryá implantujú do maternice náhradnej matky, kde ďalší vývoj prebieha. V experimente, klonovanie J. Wilmut (I. Wilmut) bola vykonaná Dolly 277 m enukleovaného vajíčka s prsníka buniek v G0 fáze z 29 prežívajúcich embryí vyvinutý len na jeden životaschopných organizmov

Dolly Klonovanie diferencovaného bunkového jadra a ostatné tri ovce z embryonálnych bunkových jadier mohli vykonávať prenosom jadra z buniek, ktoré sú v pokojovej fáze (G0), a prípadne charakteristiky zvierat embryogenézy. U oviec zygoty v prvých troch oddielov, v dĺžke niekoľkých dní, iba dôjde k replikáciu DNA, žiadna z génu nie je exprimovaný. Predpokladá sa, že v priebehu tejto doby sa zavádza DNA sa uvoľní z buniek špecifických regulačných proteínov a zodpovedajúce gény sú spojené s embryonálneho vývoja embryonálny iniciátor proteínových faktorov, z cytoplazmy vajíčka.

Kým klonovacie technológie sú ešte stále veľmi ďaleko k dokonalosti - klonoval Dolly odhaľuje mnohé známky starnutia pleti, je to veľmi sľubná technológia na výrobu transgénnych zvierat. Dokonca aj keď existujú rôzne problémy s prvej generácie, s najväčšou pravdepodobnosťou, druhá generácia nebude mať nevýhody, získaných pomocou "staré" pre vajcia jadra.

Hlavným problémom, ktorý má byť vyriešený tak, aby sa vytvorili nejaké transgénnych zvierat pomocou metódy prenosu jadra bola skutočná, - je ochrana pluripotentných buniek sa v kontinuálnej kultúre. V súčasnej dobe je aktívne vyhľadáva faktormi preprogramovanie diferencované bunky k vyvolaniu pluripotence. Ak sa to podarí, bude genetická modifikácia týchto buniek a vytvorenie transgénnych organizmov somatickou prenosom jadra sa takmer rutinné postup, a zároveň sa jedná o izolované úspešné pokusy.

Umelé chromozómy ako transgén vektora. Väčšina transgény sú cDNA malé gény (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Vzhľadom k tomu, to všetko, je použitie ocele pre transgénne kvasinkového umelého chromozómu (YAC), uzatvárajúci fragmentov genómovej DNA dĺžky 100 až > 1000 spotrebného tovaru a umelé chromozómy ešte väčšie kapacity (asi umelých chromozómov). Tieto episomální vektory majú ďalšiu výhodu - vyhnúť sa poloha efekt génovú expresiu, keď je exogénny DNA. Hladina expresie vloženého génu je silne závislá na jeho chromozomálne polohe, napríklad, vkladanie neaktívne chromatín (heterochromatin) neporušené chromozómu vedie ku génu inaktiváciu.

Použitie umelých kvasinkových chromozómov (YAC), nesúci niekoľko príbuzných génov alebo veľké gén, transgénne myši boli vytvorené mikroinjektovania do pronukleu oplodneného vajíčka alebo transfekcia ES buniek. Transgénnej myši nesúci zhluk piatich funkčné ľudský globín genovv celkovej dĺžke asi 250 spotrebného tovaru, všetky tieto gény sú exprimované tkaniva špecificky a v pravý čas presne rovnakým spôsobom, ako to robí u ľudí. Taká zhoda bola zabezpečená ich bočných sekvencií, ktoré obsahujú promótor a ďalšie regulačné elementy dôležité. Použitie YAC-transgénne myši boli získané, že syntetizované len ľudské protilátky sú tetramerický komplexná štruktúra z dvoch párov rôznych polypeptidových reťazcov.

Ľudské umelé chromozómy (ľudské umelé chromozóm -HAC), ktoré obsahujú celý ľudský imunoglobulínový lokus sa ťažký a ľahký reťazec boli zavedené do fibroblastov dobytka, ktoré sa potom používajú pre somatické prenosu jadra. Prijaté transkhromosomalnye teľatá expresiu ľudského imunoglobulínu v krvi. Tento systém bol dôležitý krok v smere živočíšnej výroby terapeutických ľudských polyklonálnych protilátok.

Ďalšie pozorovania transgénnych zvieratách ukázali, že rekombinantný HAC boli udržiavané vo väčšine prvej generácie jedincov po niekoľko rokov. Či alebo nie dostal umelé chromozómy správne oddeliť počas meiózy a zdedil, to sa ešte len uvidí.

Novšie nová sľubná technológia pre zvieratá s postihnutými génmi - malé interferujúce RNA (siRNA, siRNA), ktoré sa používajú na vypnutie zameriavacieho gény (umlčanie). RNA interferencie - konzervatívna post-transkripčný regulačný proces. Dvojvláknová malé interferujúce siRNA v 19-23 nukleotidov špecificky viažu na svoje komplementárne sekvencii templátu cieľovej mRNA, konanie sa po degradácii cesty.

RNA interferencie je súčasťou regulácie génovej expresie, a to systému kontroly / potláča transláciu mRNA endogénnych a exogénnych vírusové prvky, a môžu byť použité na terapeutické účely. Pre prechodné génové vypnutie syntetické siRNA sa transfekovaly do buniek alebo skorých embryí. Pre stabilné génovú represiu, by mal byť siRNA sekvencie začlenená do genómu ako súčasť génovej expresie konštruktu.

Veľmi účinná kombinácia lentivirových vektorov s siRNA pre integráciu do genómu. Na rozdiel od klasickej knock-out stratégie, ktorá vyžaduje dlhú chovné línie, pre získanie čistého inaktivovaný gén v oboch loci diploidný genóm siRNA Integrácia môže ľahko vypnúť cieľový gén v každom zvierat k dispozícii online.

Cez širokej škály metód pre produkciu transgénnych zvierat, až doteraz žiadne spoľahlivé a efektívne technológiu pre transgénnych zvierat. Najväčšie problémy sa vzťahujú k vloženie náhodného exogénny DNA do genómu s väčšinou existujúcich metód. Tak, že technológia zlepšenie kvality ďalej nutné vyvinúť pozorovanie modifikáciu bunkových génov a presné vloženie exogénne DNA do genómu.

Čím viac, že väčšina genómoch hospodársky významných organizmov teraz úplne sekvenovania a plánovať budúcu štruktúru transgénnych organizmov. Kombinácia plne dekódovanej genomových sekvencií s metód cielené dodávky exogénny DNA umožní konštrukciu transgénnych cieľových genómov s vopred určenými vlastnosťami.

NA Warriors, TG Volová

Delež v družabnih omrežjih:

Podobno