Krv radioimunotest (RIA) aplikácie

V roku 1956 boli prvýkrát objavené u pacientov liečených inzulínom, nepretsipitiruyuschie protilátky schopné väzby ¹³¹I-inzulín. Potom táto výskumná skupina ukázala, že neznačené inzulín súťaží sa značenú protilátkou o väzbu k a vytláča ju z imunitných komplexov. Následne Berson a Yalow vyvinula prvý metóda merania RIA koncentrácie inzulínu v sére, pre ktoré bola udelená Nobelova cena. V tejto metóde sa inzulín viazané na protilátky sa oddelí od neviazaného inzulínu papierovú elektroforézou. Približne v rovnakom čase, v roku 1960., Grodsky a Forsham opisuje podobný spôsob, ktorý využíva RIA ¹³¹I-inzulín, ale separácia viazaného a neviazaného hormónu, že bol použitý namiesto solenie elektroforéza.

Enormný príspevok k rozvoju RIA Hales a Randle vykonané v roku 1963 oddeliť viazaného aj neviazaného hormón sa používa anti-y-globulín, takzvané sekundárne protilátky. Tento prístup je založený na prácu Skoma a Talmadge, ktorý v roku 1958 ukázala, že sekundárne protilátky vyzrážanie komplexov "protilátky na antigén primárna". Hales a spôsob Randle, nazvaný "spôsob dvojité protilátky", sa ukázala byť oveľa citlivejšie a špecifickejšie než predchádzajúce verzie RIA.

V roku 1963, Herbert a spol. Vyvinuli sme techniku ​​pre separáciu komplexov "antigén-protilátka" od neviazaného antigénu aktívneho uhlia potiahnutého dextránom. Metóda je založená na vlastnosti drevené uhlie dextranové zmesi v podstate okamžite absorbovať voľného antigénu bez väzby s komplexmi antigén-protilátka. Tento postup umožňuje oddeliť imúnne komplexy oveľa byst7 rahno než pretsipitatsionnye techník, takže ho môžete použiť ¹³¹I-antigény s nízkou špecifickou aktivitou značené Hunter a Greenwood.

Video: Teach kreslená Winx?

Zároveň Utiger et al. rozšíril rozsah použitia RIA, vyvinúť metódu pre kvantifikáciu ľudského rastového hormónu. Neskôr Greenwood et al. implementovaný spôsob jodácia STH, čo umožňuje získať značený hormón sa špecifickou aktivitou 200 až 500 mCi / mg (6.000-9.000 Ci / mmol).

Táto technika sa používa dodnes. Jeho podstata spočíva v tom, že sa jód izotop (1311 alebo 1251), v zložení jodidu sodného sa oxiduje pomocou chlóramínu T a v tejto forme nahrádza jeden alebo viac atómov vodíka vo fenylovej kruhu, tyrozín a histidín imidazolového kruhu. Po 1 min sa reakčná zmes sa pridá redukčné činidlo, aby sa predišlo zbytočnému poškodeniu hormónu. Všimnite si, že zásada oxidačného jodácia proteínov bolo popísané v Hughes 1957 V ďalšom Meyer Knobil a vyvinutý pre meranie RIA opičieho a ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, Aktívne uhlie, použité pre separáciu nenaviazaného hormón.

Pôvod RIA pre meranie hladiny gonadotropným hormóny (v tomto prípade - H), vyvinuté v roku 1966, v založený na použití protilátok proti ľudskému CG, pretože bolo skôr preukázané, že tieto protilátky sa viažu na ľudský a LH. Jedným z pokusov v tejto oblasti urobila skutočnú revolúciu v imunochemie: Catt a kol. Zistili sme, že protilátky sú schopné priľnúť na diskoch diazotuje polystyrénu. Tak, čo eliminuje potrebu pre separáciu komplexov komplexu antigén-protilátka, vyzrážaním alebo adsorpcia. Neskôr Catt a kol. naučil imobilná protilátku priamo nenasýtenej polystyrénu v alkalickom prostredí. Výsledky týchto štúdií slúžili ako základ pre tvorbu ELISA (viď. Nižšie). Faiman a Ryan sa prvýkrát podarilo získať antisérum podmozgovej gonadotropínu - ľudský LH. Následne RIA pre stanovenie potkania LH boli vyvinuté.

Vývoj RIA pre meranie hladiny FSH, ako je to v prípade LH, začínajú s okom na budúce klinický výskum. V roku 1967 a 1968. niekoľko výskumných skupín správu o nové metódy RIA pre rôzne formy ľudského FSH. Všetky z nich sú založené na metóde dvojitej protilátky.

V roku 1967, Aria a Lee prvýkrát oznámili spôsob stanovenia prolaktínu, na základe spôsobu dvojitej protilátky. Prvé meranie hladiny prolaktínu pomocou RIA boli vykonané v neprítomnosti ľudského materiálu u oviec a hovädzieho dobytka plazmy.

Teoretické základy RIA

Prvý metódy RIA (napríklad, metódy Berson a Yalow alebo Grodsky a Forsham) bola založená na jave kompetitívnej inhibície. Tento jav spočíva v tom, že väzba izotopom značené hormónu (stopovacie antigén) so špecifickými protilátkami inhibované v prítomnosti neznačeného hormónu (neznačeného antigénu). Fenomén kompetitívna inhibícia možno opísať pomocou dvoch rovníc:, značený antigén + protilátka komplex je označena,a'neznačenou antigén + protilátka <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Typicky RIA vykonávané pri teplote 4 alebo 37 ° C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom pri pH 7 alebo 8. Reakčná môže trvať od 2 do 24 hodín (v závislosti na afinite protilátky a požadovanej úrovne citlivosti). Všimnite si, že automatizáciu analýzy a zlepšené spôsoby produkcie protilátok významne znižuje reakčnú dobu. Keď sa reakčná zmes, je usadený rovnováha, komplexy antigén-protilátka sa oddelí zrážaním so sekundárnymi protilátkami, antigény a absorpciou voľných protilátok na aktívnom uhlí alebo zrážaním vo vysokej hustote médiu, ako je polyetylénglykol. Ak pevnej fáze RIA, inkubačnej médium sa potom odstráni a komplexy antigén-protilátka zostane na polystyrén alebo inej pevnej fáze. V poslednom kroku rádioaktivity komplexy. V prípade, že hormón bol označený ¹²⁵I alebo ¹³¹Aj, s použitím proti žiareniu v prípade, že značka slúžil 3H, častice za použitia scintilačného čítača. koncentrácia hormónu vo vzorkách sa vypočíta z kalibračnej krivky pripravenej z meraní v štandardných vzoriek so známymi koncentráciami hormónu.

Príprava protilátok

Polyklonálne protilátka bola pripravená imunizáciou RIA antigénu (hormón) zvierat rôznych druhov, vrátane pre králiky, sliepky, morčatá, kačice, oviec a kôz. Pre primárne protilátkou (anti-hormón) sa bežne používa u králikov a morčiat pre sekundárne protilátkou (anti-primárneho) - ovce a kozy.

Video: Alergia na psie plemeno Pudel

Existuje mnoho spôsobov imunizácie, najčastejšie - injekcia antigénu do labiek, alebo v regionálnych lymfatických uzlín alebo sleziny. Vzhľadom k tomu, v hostiteľskom existujú antigény na krátku dobu, pre spoľahlivé indukciu imunitnej reakcie s použitím Freundovho adjuvans. Neimunogenetická antigény s nízkou molekulovou hmotnosťou (napríklad steroidné hormóny) a antigénov s nízkou imunogenicitou pred imunizáciu pripojené k veľké molekuly alebo častice (metylovaného albumínu, feritínu, dextrán, Sephadex a m. P.). Imunizácia sa všeobecne vykonáva v niekoľkých stupňoch v intervaloch 2 týždňov. Typicky, po niekoľkých injekciách titra protilátok v sére rýchlo rastie. Krv pre imunitného séra odobratého z dutinách srdca alebo žíl a tepien ucha. Druhá metóda sa najčastejšie používa u králikov. Výsledná séra bola inkubovaná 30 minút pri 57 ° C, aby zničil komplement. Potom sa v sére sa pridá konzervačné činidlo pre zabránenie rastu baktérií a húb (azid sodný alebo Thimerosal).

monoklonálne protilátky

V roku 1975, Kohler a Milstein vytvoril úplne nový - hybridomasy - technológia pre produkciu protilátok. Neskôr sa tento vývoj bola udelená Nobelova cena. Popíšeme hlavné prvky tejto technológie.

Myši alebo potkany sú imunizovaní s antigénom, ako je napríklad hormón. Keď sa titer protilátok v sére dostane dostatočne vysoké, v imunitných zvieratá z obec Zenk izolovaný plazmatických buniek, medzi ktorými sú bunky - producenti protilátok proti východiskovému antigénu. Plazmatické bunky v myelómových buniek in vitro hybridizovány odvodených živočícha rovnakého druhu. Bunková suspenzia bola prevedená do selekčného média, v ktorom tak hybridný bunky prežiť, a plazmové a Nye myelómové bunky hynú. Hybridné stáť po dobu jednej nasadený do jamiek chlorovodíkovej strednej podávačom, kde sú delené a vzniku hybridomasy (imortalizované bunkové línie). Z množiny vybrať tie hybridomy, ktoré produkujú protilátky s požadovanou antigén a násobiť ich médiu alebo v peritoneálnej dutine syngenních myšou. Z pitatelno- stredné alebo ascitu izolované protilátky. Tieto protilátky sa nazývajú monoklonálne, pretože sú produkované hybridomasy sú potomkami jednej plazmatické bunky. Monoklonálne protilátky produkované hybridomy, rozpozná iba jeden epitop antigénu. To je zásadný rozdiel medzi monoklonálne protilátky z polyklonálního antiséra, ktoré zvyčajne obsahuje niekoľko rôznych protilátok proti rôznym determinantám antigénu.

Jednou z dôležitých výhod monoklonálne protilátky polyklonálnych spočíva v tom, že rovnaký druh monoklonálnych protilátok s definovanou špecifickosťou a afinitou môžu byť vyrobené v ľubovoľnom množstve a prakticky nekonečné (ako nesmrteľné hybridómu). Naproti tomu, protilátkovej kompozície polyklonálního antiséra je veľmi premenná, ktorú je potrebné kontrolovať každú novú zásielku antiséra a výber podmienok jeho používania. To znamená, že použitie monoklonálnej protilátky oveľa ľahšie štandardizovať RIA a iných imunochemických testov.

Získanie hormóny, rádioaktívne značené

Ako už bolo uvedené, pre iodization proteínových hormónov najčastejšie používanou metódou navrhnutou Greenwood a Hunter. Pôvodne použitý ako značka ¹³¹Aj, ale vzhľadom na krátky polčas rozpadu tohto izotopu (8 dní) trvanlivosť značeného hormónu bol malý. V roku 1967, Wilde a spol. použité pre iodization ¹²⁵I (T_1/2 = 60 dní). Od tej doby sa izotop používa na označenie akýkoľvek proteín, a niektoré neproteínová hormóny. Takto získané označené hormóny sa špecifickou aktivitou 100-250 milicurie / mg. To je dostatočné pre spoľahlivú detekciu častíc v počítadlá žiarenia.

Pre označovanie použitia nebielkovinového hormónu a ďalšie rádioaktívne izotopy, ako sú radiátory častice ³H alebo ¹⁴C. označené ³H alebo ¹⁴C steroidy sa používajú nielen v imunochemickej analýzy hormónov, ale aj v základných endokrinologické štúdií, napríklad pre štúdium lokalizácie steroidných receptorov v rôznych bunkách a tkanivách pokusných zvierat.