Non-izotopové metódy imunoanalýzy hormónov

Jednalo sa o prvý metóda pre presné kvantitatívne stanovenie hormónov, je široko používaný a hrá obrovskú úlohu v laboratórnej diagnostiky ochorení žliaz s vnútornou sekréciou. Je založený na moderných princípoch vytvorených RIA imunologických hormóny. Avšak, v posledných dvadsiatich rokoch, RIA bol takmer úplne vyradený z klinickej praxe neizotopovými metódami imunoanalýzy - ELISA a analýzy immunohemilyuminestsentnym. Základom týchto metód, rovnako ako v RIA založené na interakciu antigénov a protilátok, ale použije sa pre štítok non-rádioaktívne izotopy, a enzýmy, ktoré katalyzujú reakciu, za vzniku farebného produktu, alebo luminiscenčné látky. V prvom prípade je konečná fáza analyzovať optickej hustoty reakčnej zmesi v druhej - počet fotónov vyžarovaných luminiscenčné látkou.

Video: Regionálne laboratórne a diagnostické centrum imunochemickej metódy výskumu IHMI

imunoanalýza

Pre kvantitatívne stanovenie hormónov najčastejšie používa na pevnej fáze ELISA s dvomi protilátkami. To sa vykonáva vo viacerých-jamkových plastových dosiek. V dolnej časti jamiek naviazané monoklonálne protilátky špecifické pre konkrétne antigénne determinant hormónu. Jamky boli sera vzorky s neznámych koncentráciou hormónov alebo štandardných vzoriek so známymi koncentráciami hormónu. Doštička bola inkubovaná po dobu 30-120 min-tej doby, hormónov molekuly podarí spojiť s protilátkami adsorbovaných na plastu. Po inkubácii boli jamky premyté pufrom na odstránenie neviazaného hormónu a ďalšie komponenty v sére. Potom boli jamky výrobu polyklonálnych protilátok na hormón konjugované s peroxidázou (tzv konjugátu), a doštička bola inkubovaná po dobu 15-30 minút. Kde molekula konjugát sa viaže na molekuly hormónov. Jamky boli znova premyté, aby sa odstránil nenaviazaný konjugát a pridá sa k roztoku, ktorý obsahuje ich bezfarebný peroxidázový substrát. Peroxidáza prevedie substrátu na farebný produkt. Intenzita farbenie roztokov v jamkách (to sa meria vo fotometra) je priamo úmerná množstvu konjugátu v studni, a to je - koncentrácia hormónu. koncentrácia hormónu vo vzorkách séra sa vypočíta z kalibračnej krivky pripravenej z meraní koncentrácií hormónov štandardných vzoriek.

Je potrebné zdôrazniť, že táto metóda ELISA, na rozdiel od vyššie popísaných spôsobov RIA, je nekompetitívny. Skutočnosť, že v reakčnej zmesi, v prípade neexistencie značeného antigénu a hladiny väzby polyklonálnych protilátok (konjugát) s antigénom, adsorbovaného na monoklonálnych protilátok je závislá na koncentrácii antigénu vo vzorke. Metódy nekompetitívny sa používajú aj pri analýze immunohemilyuminestsentnom.

Immunohemilyuminestsentny analýza

Existuje veľa možností, immunohemilyuminestsentnogo analýzy. Popíšeme príklad prevedení, ktorý sa používa na meranie hladiny gonadotropínov v modernej Autoanalyzer. V tomto prevedení, hormón sa používa na viazanie paramagnetických mikročastíc potiahnutých monoklonálne protilátky vysoko špecifické pre daný hormón. Mikročastice sa suspenduje v roztoku pufra a pridá sa k suspenzii vzoriek séra alebo štandardných vzoriek. Po krátkej inkubácii (10- 20 min) mikročastíc s naviazaným hormónu sa vyzráža v magnetickom poli a premyje sa niekoľkokrát. Potom sa mikročastice resuspendujú v pufri a pridá sa k suspenzii polyklonálnych protilátok k hormónu konjugovanej s alkalickou fosfatázou. Po premytí nenaviazaný konjugát sa pridal do suspenzie mikročastíc dioksetina fosfátu. Pôsobením alkalickej fosfatázy fosfátu dioksetina vytvorená dioksetin vyžarujúce luminiscenčné žiarenie. Intenzita luminiscencia, ktorá sa meria fotonásobičom, je priamo úmerná koncentrácii hormónu vo vzorke.

Video: Laboratórne štúdie

Metódy pre detekciu autoprotilátok

Reprodukčné poruchy môžu byť priamo alebo nepriamo spôsobené autoimunitných patologických stavov. Napríklad môže byť mužskej neplodnosti spôsobenej autoimunitné odpovede proti spermy, a v patogenéze ženskej neplodnosti môže hrať úlohu autoimunitné ochorenie štítnej žľazy alebo nadobličiek. Markery autoimunitných patológií sú autoprotilátky. Pre detekciu sérových protilátok (napr antifosfolipidové protilátky, protilátky proti yodidperoksidaze alebo 21-hydroxylázy) použitý ELISA metóda analýzy immunohemilyuminestsentny a nepriame imunofluorescencie. V druhom prípade, ako antigénne substrát pomocou hlboko zmrazené rezy tkanív, proti ktorému je autoimunitné reakcie namierená. Pre detekciu protilátok proti spermiám vo spermy a spôsob microagglutination cervikálneho hlienu používaných s latexovými časticami potiahnutými protilátkami proti IgA alebo IgG.

iné metódy

U niektorých hormónov, ako sú katecholamíny a serotonín, nie je ľahké vytvoriť spoľahlivé metódy imunologického testu. Skutočnosť, že tieto materiály majú veľmi nízkou molekulovou hmotnosťou, a proti nim je ťažké získať vysoko špecifických primárnych protilátok, monoklonálnych i. Podobné problémy vznikajú pri vývoji metód na imunochemické stanovenie steroidných hormónov a ich derivátov (vzhľadom k vysokej pravdepodobnosti skrížené reakcie s rôznymi primárnymi protilátkami steroidov, ktoré majú veľkú antigénne podobnosť). Preto je pre presné kvantitatívnu analýzu takých činidiel v posledných rokoch sa čoraz častejšie používa vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie s následnou hmotnostnej spektrometrie.

Často, endokrinné poruchy, vrátane porúch reprodukcie, nie sú spôsobené patologickými zmenami v úrovni gonadotropínu a pohlavných hormónov a ich receptorov mutácií. Na posúdenie funkcie receptora predtým použitá biologické testy in vitro: pacient sa biopsiu tkaniva, ktorá je cieľom hormónu, biopsie boli umiestnené do kultivačného média bolo pridané do média a vyhodnocované hormonálne reakcie tkaniva na tento hormón. mutácie dnes receptora zistené stanovením DNA sekvencie nukleotidov v zodpovedajúcich génov. DNA pre takéto testy sú zvyčajne pripravené z lymfocytov pacientov.