Preimplantačná génové diagnostika

Jeho kombinácia s testom na aneuploidie môže zlepšiť výsledky IVF. DNA preimplantačnej genodiagnostic pripravený z polárneho telieska, biopsia krok drvenie buď blastocysty zygota biopsie.

DNA analýza sa vykonáva na polárnom telieskom postupe oocytu fázy II. Hlavnou nevýhodou tejto metódy spočíva v tom, že za účelom potvrdenia genotypu embrya, sa vyžaduje prenatálna diagnostika. Rekombinácia chromozómov v 1. meiotického delenie môže spôsobiť chybnú diagnózu. Vo väčšine centier vykonať biopsiu embryá, ktorá môže zistiť ochorenie, zdedené od jedného rodiča. Bioptických zvyčajne získaný v stupni drvenia zygoty (krok osem buniek) selekciu buniek, 1-2. Vzhľadom na ťažkosti súvisiacim s diagnózou na takom obmedzenom materiálu (viď. Nižšie), v ideálnom prípade lepšie biopsiu blastocysty, pretože obsahuje až 300 buniek. Okrem toho sa biopsia môže užívať trofoblastu, pretože sú ľahko dostupné, a to nie je v rozpore s správny vývoj embrya. Avšak, blastocysty biopsia sa vykonáva nie vo všetkých centrách kvôli zložitosti jej kultivácii buniek v kultúre a zníženie prežitia blastocysty po kryokonzervácii. Avšak, použitie týchto metód, je možné dosiahnuť tehotenstvo, a časom, ktorý má skúsenosti, ich účinnosť je pravdepodobne vzrastie.

Materiál získaný v biopsiu, analyzované jedným z dvoch spôsobov: PCR alebo fluorescenčnej hybridizácie in situ. Laboratóriá vykonávajúce tieto skúšky musí mať certifikát vo svojej správe uviesť, ktoré bola použitá metóda, rovnako ako dekódovanie výsledkom výsledkov. Avšak, špecialista plodnosť, je nesmierne dôležité pochopiť molekulárnej a genetickej metódy preimplantačnej genodiagnostic, ich využitie a ich nevýhod.

PCR

PCR sa najlepšie hodí pre diagnózu monogenní zabolevanij použiť na určenie pohlavia embrya je tiež, aj keď to bude teraz stále viac používajú fluorescenčnej hybridizácie in situ. Pre identifikáciu pomocou PCR mutácie v konkrétnom génu, je nutné pred IVF vedieť, čo hľadať mutácie, a pre-výber reakčných podmienok. V každej reakcii, musia byť zahrnuté do príslušných pozitívnych a negatívnych kontrol, inak výsledky nemôže byť dôveryhodný. Treba pripomenúť, že v priebehu reakcie môže byť celá rada výziev, ku ktorým patrí:

1. neprítomnosť produktu PCR;
2. vzorka znečistenia;
3. Strata alel.

Okrem toho, v mnohých centrách, ak máte v úmysle použiť pre diagnostické PCR preimplantačnej, uchýlili k intracytoplazmatická injekcia spermie, aby sa zabránilo prípadné chyby v diagnostike spôsobené zavedením plášťom z priehľadnej a ďalšie spermií.

Vzhľadom k tomu, preimplantačnej genodiagnostics množstvo templátové DNA pre PCR nestačí - obvykle niekoľko pikogramov, zatiaľ čo normálne v ng PCR sto sa používajú, je potrebné zvýšiť počet amplifikačních cyklov. Ak PCR DNA odobraté z jedinej bunky (alebo viac buniek) často vyžaduje 35-60 cyklov, zatiaľ čo štandardné PCR (ak je množstvo vzorky, nie je limitujúcim faktorom) - asi 30. Ďalším riešením je PCR s primermi vnorené (alebo jeden nested primer): dve po sebe nasledujúce reakcie pre amplifikáciu malých množstvo cieľového templátu. V posledných rokoch, sme použili priméry s fluorescenčné značkou pre analýzu veľmi malých množstiev DNA, čím sa zlepší citlivosť PCR je asi 1000 krát a tým znížiť počet amplifikačních cyklov.

Pre odstránenie kontaminácii vzorky by mala byť veľmi starostlivo pripravené a reakčná zmes sa drží reaktsiyu- Okrem toho, v reakcii zahŕňajú negatívnu kontrolu (reakčnej zmesi, obsahujúce všetky zložky s výnimkou DNA). Ak je zistená negatívna kontrola PCR produkt, možnosť kontaminácie vzorky cudzej DNA - v tomto prípade sa PCR za následok zvyšok vzoriek nemôže dôverovať. Vzhľadom k tomu, použitie primérov s fluorescenčné číslom návestie PCR cyklov menšia pravdepodobnosť kontaminácie pod vzorky.

Strata alely znamená, že zosilnený v podstate jednu z alel, zatiaľ čo druhá zosilnený veľmi zle, alebo nie zosilnený vôbec. Je zrejmé, že to má najväčšiu hodnotu pri určovaní ochorení s autozomálne dominantné dedičnosti. V prípade, že "stratil" dominantné alela obsahuje mutáciu, chyba v analýze môže viesť k prenosu embrya do dutiny maternice, ktorý obsahuje mutantný gén. Možno súčasne zosilniť iný blízko seba DNA fragmentu, ktorý má vysoký stupeň polymorfizmu (viacnásobné PCR) Aby sa obišiel tento problém. Okrem toho, ako už bolo uvedené, je možné zlepšiť citlivosť PCR s použitím primerov s fluorescenčné značkou.

Asociácia preimplantačnej genodiagnostics Európskej skupiny pre ľudskú reprodukciu a embryológiu (ESHRE) vyhodnotil diagnostickú presnosť PCR a fluorescenčnej hybridizácie in situ. Podľa rokoch 1999-2001., V 81 preimplantačnej genodiagnostic prípade, potom, čo bola vykonaná PCR s použitím prenatálnej a postnatálnej diagnostika- kde je chyba v diagnostike chorôb zdedenú v Mendelian zákonov zistených v 5 prípadoch (6,2%). Opakované diagnostika na potvrdenie výsledkov bola vykonaná iba polovicu preimplantačnej diagnostiky. Je tiež potrebné vziať do úvahy prípady, keď nebolo možné vykonať biopsiu alebo nemožné diagnostikovať.

Fluorescenčná in situ hybridizácia

Táto metóda spočíva v tom, že sonda (jednovláknová DNA) nesúci fluorescenčné značku, hybridizuje s DNA z denaturovaného metafázové doštičky, jednotlivých buniek alebo tkanív. Spôsob môže byť použitý v preimplantačnej génových diagnostika pre:

1. embryo určovanie pohlavia pre choroby X-viazaných, neexistuje žiadna možnosť, aby vykonala PCR;
2. detekcia chromozomálnych translokácií;
3. detekciu zmeny v počte chromozómov;
4. objaviť iné chromozomálne abnormality, ako je napríklad aneuploidie.

V štúdii aneuploidie na možné technické ťažkosti spojené s definíciou počtu chromozómov. Ak sa pre analýzu jednotlivých buniek v interfáze prijatá, je ťažké presne určiť počet signálov (inými slovami, chromozómov) pri issleduesh jedno jediné bunky. Ak vidíte iba jeden signál, môže to znamenať, monozómie na tomto chromozóme, ale tiež prekrývajúce sa signály, alebo že hybridizácia sondy s jedným z chromozómov zlyhalo. Podobne prítomnosť troch alebo viacerých signálov môže znamenať Trizomia, ale môže byť vzhľadom k technickým problémom: dvojitý signál videnie alebo abnormálne fluorescencie. Pre predĺženie diagnostické schopnosti môže súčasne použiť aspoň tri sondy: na chromozóme X, Y chromozóm a autozómy onú z príkladu 18. chromozómu. V tomto prípade by mala laboratórium vždy prísne sledovať kvalitu hybridizácia k diagnostickej presnosti bola tak vysoká, ako je to možné, pretože je známe, že v štúdii 100 normálnych diploidných buniek 100 párov signálov pre každého chromozómu nebude schopný prijímať. Diagnostické schopnosti bude expandovať, ak to bude možné analyzovať väčší počet buniek.

V tomto zistení spôsobe translokáciou bežne používaných sond lemujúce translokáciu alebo upnuté polohy. Vzhľadom k tomu, bezprostredne po príprave pre IVF oocytov polárne telesá obsahujú kondenzované metafázové chromozómov sondy môžu byť použité pre "obraz" chromozómy v kombinácii s centromerických sond s časťami (alfa satelitných repetíciami) a určité loci. Bohužiaľ, bunky z štiepenie fáze zygoty alebo do štádia blastocysty, také sondy sú nevhodné, pretože chromozómy nemôžu byť v metafáze a nedostatočne poistkou. Spôsob, pri ktorom sa sondy použiť na subtelomeric regióny chromozómu špecifické chromozomálne translokácie dochádza medzi nimi a centromerickou časť sondy, proximálna vzhľadom k miesta translokácie. Takéto sondy môžu detekovať v interfáze dekompenzovanej translokácia, ale nemôže rozlišovať medzi normálnym chromozóme od chromozomálnych translokácií s kompenzovaným.

Podľa správy Asociácie pre preimplantačnej genodiagnostics Európskej skupiny pre ľudskú reprodukciu a embryológiu, fluorescenčnej in situ hybridizácia sa získa chybný výsledok v 8 prípadoch z 145, kedy po stanovení diagnózy vykonávané preimplantačnej prenatálnej a postnatálnej (5,5%). Medzi chybnej diagnóze - dva prípady Trizomia, jeden mozaika s trizómiou, je monosomii a jeden kompenzovaná a dekompenzované translokácie. Okrem toho štúdia o aneuploidie bol nepozorovane Trizomia chromozómu 21. Rovnako ako je tomu v prípade PCR potvrdení fluorescenčnej in situ hybridizácia výsledkov bola vykonaná za menej ako polovica žien, ktoré podstúpili preimplantačnej génové diagnostiku.

Úloha fluorescenčnej in situ hybridizácia pre stanovenie translokácie dnes nie je jasné, pretože 50-70% prípadov, keď rodičia sú nositeľmi kompenzované recipročné translokácie, kedy embryá sú dekompenzované štúdie translokácie. Tieto publikované údaje o výskyte úspešné tehotenstvo po štúdiách sa značne líšia, ale podľa údajov z troch hlavných centier frekvenciu tehotenstva, pokiaľ ide o užívanie jedno vajce je 29%. Niektorí autori uvádzajú, že preimplantačnej genetické diagnostiky znižuje riziko spontánneho aborta- ale nie je jasné, či to zvyšuje rýchlosť úspešnom ukončení tehotenstva v porovnaní s prirodzeným počatím, pretože viac ako polovica z embryí bude mať abnormality, a teda väčšia pravdepodobnosť, v každom prípade, neprežije. Napriek tomu, že preimplantačnej genetické diagnostiky testovania pre aneuploidie bola opakovane použitá s IVF, žiadny z publikovaných randomizovaných prospektívnych štúdií nepreukázala významný nárast počtu úspešného výsledku tehotenstva. IVF s preimplantačnej diagnózu - invazívne a nákladný postup, a preto je dôležité, aby presne vymedziť praktickú úlohu tejto metódy.

Združenie pre preimplantačnej genodiagnostics Európska skupina pre ľudskú reprodukciu a embryológiu

Vyvodiť správne závery z výsledkov preimplantačnej genodiagnostic pomocou PCR a fluorescenčnej hybridizácie vykonáva in situ, v praxi, že je stále ešte nie je vždy možné. Podľa správy Asociácie pre preimplantačnej genodiagnostics Európskej skupiny pre ľudskú reprodukciu a embryológiu pre 1999- 2001 dvojročné., Vykonaných v 1197 ECO cyklov, ako je ukázané na výsledkoch dodatočného prenatálnej a postnatálnej diagnózy, génovej diagnostika preimplantačnej pomocou PCR poskytla chybný výsledok v 5%, a s využitím fluorescencie hybridizácia in situ - 6% prípadov. tiež treba si uvedomiť, že následná diagnóza vykonaná menšia ako polovica času, tak, aby sa počet chybných diagnóz môže byť príliš nízka. Tieto údaje však neznamená, že v 94% prípadov správnej diagnózy bola vykonaná. Podľa asociácie sa celková miera otehotnenia po zbere vajec bolo 17%, biopsia bola úspešná v 97% prípadov, diagnózu a schopný držať iba 86% prípadov. Celkovo to znamená, že správna diagnóza preimplantačnej diagnóza bola stanovená 85% prípadov. Tí, ktorí sú podstúpiť preimplantačnej génových diagnostiku, treba upozorniť, že v 15% prípadov, správna diagnóza nemôže dať.