Hematologické účinky nové aktivity mutantný p53 do bunkového cyklu, apoptózy a citlivosti na cytostatiká

Porušenie funkcie p53 sú najuniverzálnejší v rôznych nádorov molekulyarnymizmeneniem osoby. Môžu voznikatlibo aj v normálnych bunkách a tým zvyšuje veroyatnostobrazovaniya neoplastické klonu nej, alebo môže byť uzhev nádorové bunky a určí ďalší postup novoobrazovaniya.Sleduet zdôrazniť, že zmenou regulácia kletochnogotsikla kontrolných bodov a apoptózy, p53 dysfunkcia upraviť chuvstvitelnostkletok na protinádorových liečiv.

Je pravidlom, že v nádoroch odhalil missense mutácie p53, privodyaschiek jedna aminokyselina je nahradená inou, a s najväčšou chastotoymutatsii nájdené v troch "hot spots": Kodonah175, 248 a 273. Pravdepodobne expresie mutantný p53 viaže kletkedopolnitelnye selektívnu výhodu oproti buniek, v ktorých sa mení v géne p53 viesť k strate ekspressiipovrezhdennogo alely. Túto skutočnosť možno vysvetliť tým, krayneymere dvoch dôvodov. Po prvé, mutantný proteín má dominantné negativnymeffektom proti proteínu divokého typu, tj mutatsiyadazhe bod v jednej z dvoch alel, je schopný úplne potlačiť ohrannuyufunktsiyu p53. Po druhé, v posledných rokoch sú uvedené údaje naznačujúce existenciu mutovaných foriem p53 novozískaných aktivít ("získajú-of-function"). Je známe, napríklad, že pre schettakih aktivity mutantné p53 sa môže špecificky a s vysokoyaffinnostyu viažu MAR / SAR DNA prvky, čo spôsobuje remodelirovaniehromatina, trans-aktivovať promótory niekoľkých génov (onkogénov myc, receptor epidermálneho rastového faktora a ďalšie.) A uvelichivatmetastatichesky potenciál nádorové bunky. Avšak molekulyarnyeosnovy novo získané činností a ich úloha je prakticky nebola študovaná kantserogenezapoka procesov.

Pokúsili sme sa skúmať vplyv novo priobretennyhaktivnostey mutantný p53 na reguláciu bunkového cyklu, apoptozai citlivosti na cytostatiká. K tomu, aby sme boli študované effektymutantnyh p53 aminokyselinové substitúcie v kodónoch 175, 248 ili273 bytia "hot spots" razlichnyhopuholyah mutácií u ľudí. Nový mutantný p53 aktivita bola detekovaná transdukcia do kultivovaných buniek in vitro bez produtsiruyuschieendogenny p53. Použitie buniek zbavených p53 ekspressiyaendogennogo, možné vylúčiť existenciu dominantné-negativnogoeffekta a skúmanie účinku novo získané iba aktivnosteytransdutsirovannogo mutantný p53.

Získali sme a deriváty ľudské bunky analyzované myshii konštitutívny alebo tetracyklín-represibilní ekspressieyekzogennogo p53. V druhom prípade, expresia mutantního r53podavlyalas pridaním tetracyklínu do kultivačného média (1mkg / ml). 24-48 hodín po prenose kontaktné subliniykletok získané v médiu bez tetracyklínu indukcie pozorované ekspressiiekzogennogo mutantný p53 nie je sprevádzané zvýšením ekspressiigenov cieľovej divokého proteínu p53 (p21WAF1 et al.).

Vplyv nových aktivít mutantný p53 v bunkovom cykle miera bunkovej proliferácie

Novo získané mutantný p53 aktivita spôsobuje suschestvennoeuvelichenie rýchlosť proliferácie buniek. Tak, zavedenie vektora konštitutívne exprimujúcich mutantný p53-His175, povyshaetskorost reprodukčné p53-negatívne myšou fibroblasty linii10 (3) je približne 1,5:. Znížil z 23,5 hodín do 16 hodín v logaritmickej fáze rastu populácie buniek bolo pozorované vremyaudvoeniya Shodnayakartina v prípade tetracyklínom regulovaný ekspressiir53-His175 v ľudského pľúcneho karcinómu línie N1299ili myšou fibroblastové línie 10 (1), čo potvrdzuje, že sa svyazvyyavlennyh rozdiely v rýchlosti proliferácie ekspressieymutantnogo presne s p53, a nie s sekundárne zmeny voznikayuschimiv výsledkom kontinuálneho selekčného s exogénny mutantnymr53 bunkami. Malo by byť zdôraznené, že indukcia expresie p53 divokého typu bunkových kontextoch neviedla k poklesu, ale uvelicheniyuvremeni zdvojnásobenie bunkové populácie alebo apoptózy.

Zrýchlenie bunkovej proliferácie pod vplyvom novo priobretennyhaktivnostey mutantný p53 je spôsobené, zdá sa, že ich vozdeystviemna reguláciu bunkového cyklu. Analýza kinetiky vzhľadu mechenyhmitozov po pridaní 5-bromdeoxyuridinu po dobu 20 min., Sme opredelyaliprodolzhitelnost jednotlivých fáz bunkového cyklu rastu logarifmicheskoyfaze. Bolo zistené, že zahrnutie expresia mutantního r53znachitelno skracuje čas pre bunkového cyklu trvania skrátenie schetsuschestvennogo S-fáze. Tak mutantnyyr53 žiadny významný vplyv na trvanie drugihfaz bunkového cyklu.

Novo získané mutantný p53 aktivity, navyše k izmeneniyregulyatsii bunkového cyklu za normálnych fyziologických podmienok, môžu modifikovať G1-kontrolný bod funkcie aktivovateľné povrezhdayuschimivozdeystviyami. Zistili sme, že indukcia expresie mutantnogor53-His175 buniek 10 (1) a H1299 vedie k tomu, že sa S-fazuvhodit 1,5-2 krát viac buniek s poškodením DNA, indutsirovannymialkiliruyuschim zlúčenina etyl-methansulfonát (EMS), potom p53 divokého kakekspressiya typ, naopak znižuje podiel povrezhdennyhkletok obsiahnutý v s-fáze. V rovnakej dobe, p53-His175 prakticheskine ovplyvňuje činnosť kontrolného bodu pôsobí v G2.

Mechanizmy sme identifikovali účinky novozískaných aktivnosteymutantnogo p53 v regulácii bunkového cyklu, kým neyasny.Naibolee vierohodné, je predpoklad, že tieto izmeneniyasvyazany so schopnosťou p53-His175 zvýšenie expresie genamyc. Jeho produkt, ako už bolo uvedené, môže, na jednej strane, trans-aktivovať gén ornitindekarboxyláza, a volanie, a tým ochorenie, skrátenie S-fáza, a na druhej strane aktivovať kompleksytsiklin E / CDK2 a zrušiť zastaviť poškodené bunky v perehodeiz G1 až S ,

Vplyv nových aktivít mutantný p53 v indukcii apoptózy

Mutantný p53 môže modifikovať účinok cytostatík, iba izmenyayane regulácia G1-kontrolný bod, ale aj oslabenie indukcii apoptoza.Pri tejto novej aktivity mutantního p53 pôsobí ako naapoptoz spôsobené poškodenie DNA a apoptózu indukovanú"doména smrti" ("receptory smrti") V médiu kultúry posledobavleniya TNF-a alebo anti-Fas. Sleduetpodcherknut, že tieto účinky mutantný p53 vo veľkom stepenizavisyat na špecifické substitúcie aminokyselín, ako je napríklad apoptóza a možno aj bunkových súvislostiach. Tak, p53-His175, oveľa silnejšie ako p53-Trp248 alebo p53-His273, inhibuje apoptózu indukovanú DNA povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, etopozid). V rovnakej dobe, p53-His273 silnejší ako p53-His175, potláča Fas-indukovanej apoptózy v karcinómu prostaty chelovecheskihkletkah líniu PC-3. Okrem toho, rôzne mutantnyer53 rôzne ovplyvňovať apoptózu indukovanú Fasi TNF-a.

Mechanizmus účinku novo získaných aktivít v oblasti regulácie apoptózy mutantnyhr53 študoval až celkom zlé. Nedavnoobnaruzheno, že jedným zo spôsobov, také regulácia môže yavlyatsyatrans kabelky1-aktiváciu génu kódujúceho antiapoptotických beloksemeystva BCL2.

Vplyv nových aktivít mutovaného proteínu p53 v chemoterapeutickej lieky chuvstvitelnostk

Okrem nešpecifické účinky na citlivosť na tsitostatikamposredstvom zmeny v regulácii bunkového cyklu a apoptózy, novyeaktivnosti mutant p53 môže mať väčšiu citlivosť spetsificheskoedeystvie na niektoré lieky sredstvamputem zmeny v regulácii chemoterapie cieľov. Použitie hybridizačný metodsubtraktivnoy sme identifikovali neznámy raneemisheni transaktivaci mutantný p53 účinku a bolo zistené, že skupina génov špecificky aktivovaný mutovaného génu p53 obsahuje kódujúci deoxy-UTP-ASE. Funkčného dUTFazy zaklyuchaetsyav hydrolýzy dUTP na skládku a pyrofosfát. Na druhej strane, za vzniku Dump sluzhitsubstratom dTTP de novo. Predpokladá sa, že povyshenieurovnya dUTFazy môže spôsobiť rezistenciu na 5-fluóruracilu sú, shirokoprimenyaemomu chemoterapeutickej látky, ktorých mechanizmus účinku inhibíciou syntézy svyazans dTTP timidilatsintetazy.My potlačením aktivity zistené, že indukcia p53-His175 alebo p53-His248, ako aj zavedenie konštruktu vyjadrujúce UTP -azu, dokonca aj vo všetkých skúmaných kultúrach (karcinóm pľúc H1299, rakyaichnika Skov-3, fibroblastov 10 (1), do 1,5 až 2 krát zvýšená chislokletok schopné tvoriť kolónie po expozícii na 5-fluorouracil A.Pre tento odpor na dvoch rôznych liekov - metotreksatui adriamycín - nezvýšil súčasne p53-His273, neobladayuschy schopností trans-aktivovať génový UTP-ase nie uvelichivalustoychivost údaje kultiváciu buniek na 5-fluóruracilu sú ..

Je zrejmé, že existujú aj iné spôsoby, v ktorých mutant p53 aktivita vnovpriobretennye vplyvu chuvstvitelnostkletok na určité cytostatík. Tak bolo zistené, že vleykoznyh K562 bunky, na rozdiel od buniek 10 (1), a kol., Expression of p53-His175 spôsobí značnú redukciu chuvstvitelnostik metotrexát. Expresia tohto mutanta málo uvelichivalatakzhe rezistencia leukemických buniek k vinblastín akčné noprakticheski nezmenila citlivosť na etopozidu. V rovnakej dobe, expresie p53-His273 nie je znížená, ale naopak, niekoľko povyshalachuvstvitelnost buniek K562 k metotrexátu, a vinblastín. Mehanizmyetih účinky zostávajú nejasné.

Tak bolo zistené, že novo získané aktivnostimutantnyh p53 substitúcie aminokyselín v rôznych polohách razlichnymobrazom ovplyvňovať citlivosť na rôzne chemoterapeutickej lieky. Prietom sa môžu líšiť nielen účinok rôznych mutantný p53 vody a rovnaký typ buniek, ale aj pôsobenie rovnakých mutantav buniek rôzneho pôvodu. To všetko je nutné uchityvatpri prebiehajúce pokusy ispolzovatmutatsii p53 predvídať výsledky protinádorovej chemoterapie.