Metódy pre izoláciu polyribosomes. Rozmery polyribosomes syntetizovať protilátky

V súčasnej dobe, vyzdvihnúť polyribosomes z lymfatického tkaniva a myelómu nádory zvyčajne používať ich homogenizácia v Tris pufri roztokoch (pH 7,0 až 7,6), s obsahom sacharózy, KCl (alebo menej - NaCl), MgCl 2 (alebo octanu horečnatého) a niektorého z inhibítora RNázy (častejšie - heparín). Predpokladom je použitie činidiel, ktoré neobsahujú žiadne RNase. Prvý odstránený z homogenátu jadra a mitochondrií postmitochondrial supernatant bol pridaný do niektorého z detergentu (deoxycholát sodný alebo Triton X-100) sa rozpustí enodoplazmaticheskogo retikula membránu a vyzráža polirobosomy (alebo frakcionovaný) v kroku (0,5-1,5 M) alebo lineárne (zvyčajne 15 až 30% roztok), sacharózy gradienty. Výťažok poliribosomnogo materiál je v tomto prípade 30-50% všetkých bunkových ribozómov.

stupeň narodenia polyribosomes, získané z rôznych zdrojov, vplyv na koncentrácie sacharózy, iónová sila a pH pomere tlmivého roztoku sa používa K / Mg a povahu detergentu. Tak, pre polyribosomes zo sleziny výhodné použiť Triton X-100, rovnako ako v prítomnosti deoxycholátu sodného vyznačujú degradácii. V niektorých prípadoch sa tiež odporúča prídavok malých množstiev SaS12 alebo spermidín zvyšujúcich stabilitu bunkových jadier (Goryunova et al., 1974- stenu napr. A., 1977), a 2-mercaptoetanolu (Schechter, 1973). Za účelom zníženia doby kontaktu polyribosomes z bunkového lyzátu sa môže tiež priamo aplikovať na bunky, ktoré obsahujú detergentné inhibítor nalaminovanou priamo na sacharózové gradientu. V tomto prípade, v priebehu odstreďovania kletkp súčasne lyžovania a frakcionované (Davis napr. A., 1969).

Je potrebné poznamenať, že izolácia natívneho polyribosomes bunky z lymfatických tkanivách normálnych alebo imunizovaného živočíšne tkaniva je oveľa zložitejšie a menej rozvinuté postup než ich oddelenie od plasmacytomy. Možno, že je to spôsobené tým, že je endogénna inhibítor RNase plazmocytóm, zatiaľ čo v slezine a lymfatických uzlinách, to tak nie je, a RNázová aktivita v imunizáciu ešte zvyšuje.

podstatný role, zrejme hrá druh zvieraťa. Najpriaznivejšie objekty, údaje riadok sú sleziny a lymfatické uzliny z krysy, z ktorých je možné získať natívny polyribosomes, sedimentáciu v 250-350S a 160-190S obsahujúci aktívne pulzu a značku aminokyselín (Vassalli, 1967- Vasil et al., 1969). Existujú tiež správy o pridelení natívnych polyribosomes zo sleziny králikov (Becker, Rich, 1966- Scharff, Uhr, 1965) a morčiat (Nikolaeva, 1976). Vzhľadom k tomu, nádorového tkaniva najbohatším zdrojom polyribosomes sú mielomy- lymfóm v menšom počte týchto organel (Sherr, Uhr, 1971).

Výsledkom je, že zlepšenie frakcionáciou technika lymfatického tkaniva zvierat bunky a myší plasmacytomy podarilo izolovať širokú škálu polyribosomes sa sedimentačné konštantou od 118s až 350S. Bolo dokázané, že množstvo imunizácia polyribosomes a pol až dvakrát zvyšuje (Moav, Harris, 1970- Yurina, 1971), a ich špecifické distribúcia stáva dvojfázovú povahu. Podobné údaje o myelómových buniek boli získané Schubert (Schubert, 1968) a kontakt (Sidorov a kol., 1973).

To bolo navrhol, že dvojfázová distribúcia polyribosomes, značený tým, rastúcich polypeptidových reťazcov odrážať prítomnosť dvoch tried polyribosomes zapojených do syntézy H- a L reťazca. Imunoprecipitačné experimenty s polyribosomes antiséra H a L reťazca bolo skutočne preukázané, že H-reťazec detekované len na polyribosomes 270-300S, a L-reťazec - s výhodou na polyribosomes 180-190S (Shapiro ea, 1966a- Askonas, Williamson, 1967b ). Podľa výpočtov vykonávaných autormi, by mali tieto polyribosomes obsahovať mRNA, ktorá sa skladá z približne 1250 a 500 nukleotidy, napr. E. veľmi vhodné pre kódovanie syntézu H- a L reťazca.

dáta získané Dva zásadne dôležité závery, a to: 1) syntéza imunoglobulínov je monotsistronnyi povaha a 2) veľkosť polyribosomes a mRNA sa podieľajú na tvorbe H- a L reťazca, sú dostatočné pre kódovanie syntézu každého z nich ako celku.