VWF antigénu: spôsob určenia

Na povrchu plastových jamiek doštičky naviazané protilátok proti von Willebrandovho faktora. V prvej fáze výskumu v jamke mikrotitračnej doštičky sa pridá BTP vzoriek. VWF molekúl sú upevnené na príslušných protilátok, a zostávajú viazané pri praní. V druhom kroku v analýze jamky tvorby polyklonálnej protilátky. V ďalšej fáze vyšetrovania v jamke chromogén roztoku sa pridá. Táto látka je natretá po enzýmom. Intenzita farbenia závisí od obsahu von Willebrandovho faktora.

Imunologický spôsob stanovenia von Willebrandov faktor môže byť tiež vykonaná za použitia raketového elektroforézy.

Variačný koeficient ELISA pre stanovenie vWF: Ag je menšia ako 10%.

Video: Stanovenie krvnej skupiny a Rh faktoru

Reagenty a zariadenia

• Koncentrát premývacieho pufra (pH 7,3).
• inkubačnú pufer (PBS- pH 7,3).
• Lyofilizovanej štandardy.
• Lyofilizované kontrolné vzorky s nízkou a vysokou úrovňou.
• Konjugát polyklonálnych protilátok.
• roztok substrátu.
• Prestať riešenie.

Video: Krv (antigény krvných skupín, Rh) [Je to jednoduché]

Distribútor Diagnostická súprava činidiel - CJSC "BIOHIMMAK".

Krvné vzorky pre výskum

Ak chcete vykonať skúšobné Willebrandov faktor pomocou PPP.

výkon technika

Konštrukcia kalibračnej krivky. Ďalej je potrebné pre vytvorenie kalibračnej krivky pomocou lineárny systém súradníc. Pre konštrukciu kalibračnej krivky pomocou hodnotu absorbancie získané zriedením vzorky so známou koncentráciou von Willebrandovho faktora. Na osi x je aplikovaný na koncentrácii VWF: Ag v U / ml alebo percent (1 U / ml = 100%) a na osi y uvádza absorbanciu. V tých prípadoch, kde sú vzorky, ktorých hodnota absorbancie väčšia, než je hodnota najvyššieho kalibračného bodu, musí byť ďalej zriedený inkubačnom pufri (1 + 1) a znovu testované. Tak výsledná koncentrácia merania musí vynásobiť faktorom zriedenia.

Vyhodnotenie výsledkov štúdie

Koncentrácia vWF: Ag u zdravých ľudí sa veľmi líšia. Predpisy sú závislé na verziu diagnostické súpravy, zariadenie, krv, činidiel, a ešte oveľa viac, takže nie je všeobecne prijímanej normálne rozmedzí pri meraní tohto ukazovateľa. Normálny rozsah je obvykle uvedené v návode výrobcu činidiel pre stanovenie von Willebrandovho faktora, ale mnohí výrobcovia odporúčajú, aby si každé laboratórium stanovila svoj vlastný rozsah normálnych hodnôt. Je dôležité si uvedomiť, že priemerné hodnoty hladiny tohto proteínu s Aj krvnej skupiny je asi o 10% nižšia ako u iných pacientov, ktoré by mali byť vždy považované v diagnóze hemoragickej choroby.

príčiny chýb

• Absencia alebo neúčinnosť systému vnútornej kontroly kvality. V súčasnej dobe k dispozícii vzorky referenčných materiálov certifikovanej hodnoty s von Willebrandovho faktora. Vzhľadom k tomu, že prítomnosť zásadne odlišných metodologických prístupov na určenie bielkovín, je nutné starostlivo skontrolovať verziu štúdie, pre ktoré bol testovaný vzorku certifikovaného.
• Nesprávne dávkovanie citrátu na odber žilovej krvi. Nedostatok citrátu sodného, ​​pretože nízky hematokrit a hemolýzy viesť k chybám a non-reprodukovateľné výsledky.
• Hemolýza.
• Zvýšenie vWF pozorované v stresových situáciách v priebehu cvičenia, tehotenstva, krvácanie, vysoký krvný tlak, infekčných chorôb, estrogénovej terapie. U žien, u rôznych dní menštruačného cyklu, môže byť kolísanie koncentrácie von Willebrandovho faktora. Štandardizovať hormonálne vplyv na obsahu multimerní proteín, niektorí odborníci odporúčajú pre diagnostiku von Willebrandovho ochorenia u žien medzi 5. a 7. deň menštruačného cyklu.

Ďalší analytické techniky

Bohužiaľ, neexistuje žiadny jednotný postup, ktorý môže vziať do úvahy všetky z mnohých variantov tohto proteínu anomálií, ale pre diagnostiku VWD vyvinula rad laboratórnych testov. Základné výskumné metódy používané na identifikáciu nedostatkov alebo kvalitatívny abnormalitu von Willebrandovho faktora, založené na použití enzýmových imunologických techník. Okrem toho, pre diagnostiku ochorení študovať efektívne funkciu agregácie bežných krvných doštičiek ošetrených ristocetín pridanie PRP vyšetrovaného. Za účelom kvalitatívneho poruchy diferenciácie molekuly tohto proteínu ďalej zamestnancov a ďalšie metodické postupy.

Určenie ristocetín-kofaktora von Willebrandovho faktora

Formalínom ošetrené doštičky strácajú schopnosť vykonávať mnoho z jeho funkcie, r. H. tvorbu a funkčné jednotky, v závislosti na prídavku najviac známe funkcie induktory agregácie, ale s pridaním ristocetín v zmesi týchto doštičiek a plazmy štúdie, ktoré sa rýchlo, zhlukujú. V tomto skúšobnom systéme závažnosť aglutinácia je priamo závislá na prítomnosti von Willebrandovho faktora, avšak s klesajúcou koncentráciou tohto proteínu alebo jeho kvalita menejcennosti také aglutinácia slabo exprimovaný alebo chýba úplne. Existujú dve možnosti prinitsipialno podobné metodiky pre stanovenie ristocetín-kofaktora von Willebrandovho faktora. Pôvod - kvantitatívne, na jeho vykonanie vyžaduje agregometru, druhý - semikvantitatívny, zahŕňa vizuálne posúdenie okamihu výskytu aglutináty v zmesi riedení testovanej plazmy a ristocetín formalínom ošetrené krvné doštičky. Obe metódy majú koeficient odchýlky menšie ako 10%.

Diagnostické metódy nutné rozlišovať rôzne verzie von Willebrandovej choroby

Stanovenie kolagénu viažuci aktivity von Willebrandovho faktora. Adhézie krvných doštičiek na subendoteliálnych kolagénových vlákien uskutočňuje prostredníctvom receptora krvných doštičiek GP-Ib / V / IX. Táto interakcia vyžaduje vWF ako kofaktor, takže v anomálií multimerní proteín alebo jeho nedostatočná kapacita narušený väzby na receptory kolagénu doštičiek. Na stanovenie aktivity kolagénu väzba vyžaduje súbor činidiel a zariadenia na vykonanie testu ELISA. Jeho koeficient odchýlky nie je vyššia ako 15%.

Stanovenie multimérního von Willebrandovho faktora. Moderné diferenciálnu diagnostiku väčšiny variantov typu 2 VWD je tiež založený na štúdium multimerní von Willebrandovho faktora. Pre stanovenie schopnosti tohto proteínu tvoriť multimery čoraz viac používajú imunitný elektroforézy. Postup na stanovenie multimerní pomerne komplikované, vyžaduje zariadenie pre imunitný elektroforézy vhodné vykonávať v špecializovaných laboratóriách rutinne vykonávať imunitný elektroforézy, diagnostické súpravy pre jeho realizácia nie je. Informácie o citlivosti a špecifickosti tejto diagnostické metódy v súčasnej literatúre nie je zastúpený, ale existujú správy o doteraz neznámych verzií multimerního proteínu, ktorý niektorí odborníci považujú ako diagnostické artefakty.

Stanovenie agregácie krvných doštičiek s ristocetín (R1PA). Porušenie agregácie trombocytov indukovanú ristocetín je časté laboratórne Willebrandova prejavom ochorenia. Toto prevedenie pre identifikáciu vysoko špecifický subtyp 2B von Willebrandovho choroba, v ktorých je abnormálne vysoká agregácie v odpovedi na prídavok nízkych koncentrácií ristocetín. V iných anomálií, táto metóda je len druhoradý význam, pretože je zvyčajne dávka môže byť rozdelená na rôzne prevedenia tejto patológie. Ak chcete implementovať túto techniku ​​vyžaduje agregometru a ristocetinového. Reprodukovateľnosť štúdie agregácie s ristocetín do značnej miery závisí na agregometru modelu, skúseností a odbornú prípravu pracovníkov.

Video: Krv zoskupenia by prestrelke a Rh faktoru