Terapia-efekt gény zodpovedné za syntézu proteínov aktínu a srdcové dystrofínu na rozvoj chronického srdcového zlyhania u pacientov s dilatačnou kardiomyopatiou infarktom miokardai

DAk chcete porozumieť mechanizmom vzniku a progresiu zlyhania hronicheskoyserdechnoy (CHF) Research poslednihlet zameria na posúdenie prínosu genetických faktorov vrazvitie obehové zlyhanie. Perspektivnympodhodom To je spôsobené tým, že sa detekuje genetické riziko a proiskhoditprognozirovanie komplikácií tohto ochorenia až do ich klinicheskihproyavleny [1, 2]. Preto v súčasnej dobe na molekulárnej patogenéze kardiomyopatia urovnerassmatrivaetsya ako proiskhoditnarushenie v procese génovej expresie, najmä mehanizmovpretranslyatsii, preklad a posttranslyatsii, ktorá vedie k izmeneniyufenotipa [2]. Známy činnosť s cieľom identifikovať genetické faktorovrazvitiya CHF u pacientov s dilatačnou kardiomyopatiou (DCM), a to najmä v týchto pacientov odhalila mutácie v rôznych uchastkahgenov zodpovedné za syntézu proteínu dystrofín a aktínu [3, 4,5, 6].
Neexistujú žiadne publikované správy o mutatsiigena dystrofínu a aktínu u pacientov s infarktom myokardu, hotyamozhno predpokladať, že podobné mutácie je možné na základe vliyaniemstressa a neurohormonálne aktivácia mechanizmov.
V tejto súvislosti je cieľom tejto práce bolo issledovaniegenov aktínu a dystrofín u pacientov s idiopatickou dilatačná kardiomyopatia, UY osôb s infarktom myokardu.

Materiály a metódy

V issledovanievklyucheno 130 pacientov, vrátane 104 mužov a 26 žien, vozrasteot 21 až 88 rokov. Pacienti boli rozdelení do troch skupín: prvá skupinové macrofocal a pacienti s akútnym infarktom myokardu transmurálneho, komplikovaný CHF II - IV FC podľa NYHA, 2. skupina - s infarktom miokardabez klinickými príznakmi srdcového zlyhania, 3. skupinové pacientov s idiopatickou dilatačnou kardiomyopatiou CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo skupina 30 ľudí, vrátane 21 mužov a 9 žien, vozrasteot 25 až 76 rokov (priemerný vek 55,5 rokov) bez kardiovaskulárneho sosudistoypatologii a bez vážnych chronických ochorení.
Klinické a demografické charakteristiky bolnyhpredstavlena stôl.
Štúdium génov aktínu a dystrofín proizvodilosv Ústavu General Genetics, laboratórne a radiatsionnoygenetiki environmentálne Ústavu biológie génu rás.
tselnayakrov bola použitá pre extrakciu DNA, ktoré boli v skúmavke s EDTA v konečnej koncentrácii 50mMili citrátu s konečnou koncentráciou 0,5%. Izolácia DNA provodilis za použitia "DiatomTMDNA Prep 200" reagentné súpravy (vyrobené "Biokom"). Základom izoláciu DNA pomocou tohto použitie naboralezhit na lýzu činidla k DNA guanidintiotsionatomi sorbentu "Nucleos". V prítomnosti vysokých koncentrácií guanidintiotsionata (4M) DNA adsorbuje na aktívnom povrchu častíc "Nucleos", a ostatné krvné komponenty zostávajú v médiu, ktoré je potom udalyayutsyatsentrifugirovaniem. DNA premyje spirtosolevym vyrovnávacej zatemsmyvaetsya extragenic sorbentu zmesou iónomeniča a pre nastavenie napryamuyuispolzuetsya polymerázová reťazová reakcia (PCR) Izolácia DNA z krvi vykonané v súlade so súborom instruktsieyispolzovannogo "DiatomTMDNA Prep 200" "Biokom" firmy.
Pre detekciu mutácií v géne metódou kardioaktinaispolzovali PCR-RFLP, PCR produktu, pričom reštrikčné rezhetsyasootvetstvuyuschey enzým rozpoznáva na body záujmu nukleotidnuyuzamenu. Štiepenia enzýmom reštrikčné miesto Bcl I (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutáciu G (norm) pre A (mutácie), rozpustený v génovej kardioaktina 5-exon spojené s idiopatickej dilatačná kardiomyopatia. Sintezpraymerov pre výskum 5. exónov bol kardioaktina držanie syntezátor PE Applied Biosystems (USA). Zloženie primery: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR amplifikácie bola vykonaná nasledujúcim spôsobom: rezhimeamplifikatsii 950S - 40, 580SM - 30, 740S - 40 až 30 cykloch.
Veľkosť amplifikovaného fragmentu 222 parynukleotidov. Konečné koncentrácie v reakčnej zmesi PCR: 67 mM Tris HCl pH c = 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jednotiek. Taq.polimerazy, 200 mM dNTP každý, 0,5 mM každého primeru 10-20ng DNA skúmané, 1,5 mM MgCl₂,Konečný objem PCR zmesi 30 ml.
Pre analýzu amplifikácie za následok 10 mklPTsR produkt sa nanesie na 2% elektroforézou na agarosovém gélu. vgele DNA vyvinutý s etidiumbromidom pod UV svetlom s vlnovou dĺžkou 32 nm. Po vizuálnej hodnotenia PCR koncentrácia produktu opredelyaliobem PCR zmes potrebných pre nastavenie obmedzenia reakcie (5 až 10 l PCR zmesi).

Vyšetrovanie dystrofínového génu

Pre obnaruzheniyamutatsii v géne pre dystrofín metódou PCR s sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), pričom ispolzuetsyapara pre PCR primeru, z ktorých jedna obsahuje jeden alebo dva tochechnyezameny. Jedným z substitúcia je zaujímavá náhrada tochechnuyunukleotidnuyu. Princíp tejto metódy je, že sa teplota prioptimalnoy napojené priméry v neprítomnosti mutácie sa objaví konkrétny pásmo PCR produktu, a v prípade mutatsiipri rovnakej teplote a žíhanie primery amplifikatsiine reakcia prebieha. Vybrané dva páry sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny detekovať missense mutácie A až G v 9. ekzonegena dystrofínu normálnej sekvencie a mutácie sootvetstvennosvyazannaya s X-viazanou idiopatickej dilatačná kardiomyopatia.
Syntéza primérov pre výskum 5. ekzonakardioaktina bola vykonaná na syntetizátora PE Applied Biosystems (USA).
Zloženie primeru: Dn 5-GTA AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GAA CCT CTC CAG TCG ATC ACG Dm 5-GTA AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GGA TCC TCT CTC GCA CGC gat
PCR amplifikácie bola vykonaná nasledujúcim spôsobom: rezhimeamplifikatsii 950S - 40 s, 560C - 30, 740S - 40 pre 35 cyklov.
Veľkosť amplifikovaného fragmentu 160 parnukleotidov. Konečné koncentrácie v reakčnej zmesi PCR: 67 mM Tris HCl c pH = 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jednotiek. Taq polymeráza, 200 mM dNTP každý, 0,5 mM každého primeru 10-20ng DNA skúmané, 1,5 mM MgCl₂,Konečný objem PCR zmesi 30 ml.
Tabuľka. Klinické a demografické charakteristiky pacientov.

Pre analýzu rezultatovamplifikatsii 10 ul produktu PCR bola nanesená na 2,5% agarózovom géli ukázala elektroforez.DNK gélu Ethidium bromidom pod UV svetlom dlho volny320 nm.
Pre detekciu bodovú mutáciu v issleduemyhprobah zaznamenanej amplifitsirovannogofragmenta prítomnosti alebo neprítomnosti príslušného páru primerov:
1. Prítomnosť PCR fragmentu o 160 párov nukleotidovpri zosilnenie pár primérov pre normálnu posledovatelnostiukazyvaet na normu.
2. Neprítomnosť PCR fragmentu s 160 parnukleotidov amplifikačného páru primérov pre normalnoyposledovatelnosti indikuje prítomnosť zamýšľaného mutácie.
3. Prítomnosť PCR fragmentu o 160 pároch nukleotidovpri zosilnenie pár primérov pre mutatsieypodtverzhdaet sekvencie s mutáciou.

Výsledky a diskusia

Ako už bolo spomenuté, v literatúre neexistujú žiadne správy o mutáciu génu iaktina dystrofínu u pacientov s ischemickou chorobou srdca, najmä sinfarktom myokardu, aj keď pod vplyvom neurohormónov a ďalších biologicheskiaktivnyh látok, ktoré sú aktivované v odpovedi na povrezhdenieserdechnoy sval (v tomto prípade, infarkt myokardu), vozmozhnopredpolozhit podobné mutácie. Avšak, aj napriek podmienok pravilnyeteoreticheskie a naše očakávania bolo zistené, že mutácie génov sledovaných pacientov. Okrem toho, nie je opredelyalasmutatsiya a u pacientov s dilatačnou kardiomyopatiou, aj keď sa v posledných rokoch vo výskume rezultateryada získať dostatok významné výsledky v dôsledku kotoryekasayutsya dystrofínu génovú mutáciu a aktínu s srdca nedostatochnostyu.V najmä R. Ortiz-Lopez et al. [2] skúmané genomnuyuDNK 3 nepríbuzných rodín s X-viazanou dilatačné kardiomyopatiou.Kontrolný skupinu tvorilo 50 ženských jedincov a 50 mužských neyavlyayuschihsya príbuznými. Pre amplifikáciu DNA bol použitý výsledok PTSR.V štúdie v jednej z rodín s X-viazanou DKMPbyla identifikovaný gén kódujúci mutácie dystrofín lokalizuyuschegosyav chromozómu 21, a to najmä, našiel nahradenie adenínu guaninv exónov 9 v polohe 1043, ktorá viedla k syntéze hydrofóbna nepolyarnoyaminokisloty alanín miesto hydrofilné polárne treonínu prítomné v dystrofínu v polohe 279, ktorý sa týka KN-konci proteínu dystrofínu. Nahradenie treonínu alanínom izmeneniyupolyarnosti vedie k N-koncu proteínu, a teda zmena vtorichnoyi dystrofínu terciárne štruktúry. Tak, tento mutatsiyayavlyaetsya spôsobiť stratu membránové stabilizačnej funkcie etogobelka porúch a funkčné aktivity kardiomyocytov, chto vedie k X-viazaných degeneratívnych ochorení miokarda- X-viazanú dilatačná kardiomyopatia.
F. Muntoni a kol. [4], a Milasín J. a kol. [5], popísané mutácie v iných miestach distrofina.Eti génové úseky boli skúmané R. Ortiz-Lopes et al. [3] tehzhe 3 rodiny s X-viazanou dilatačná kardiomyopatia, mutácie v týchto miestach boli vyyavlenone. V dôsledku toho môžeme uvažovať o rôznych mechanizmov veduschihk vývoja distrofinopaties.
Preto každá mutácia distrofinaprivodit k deficitu infarktu proteínu, ktorý yavlyaetsyaprichinoy absencia infarktu distrofinassotsiirovannyh glykoproteínov [7, 8] zodpovedné za väzbu komplexu multiproteinnogo sbelkami extracelulárnej matrix. Výsledkom toho yavlyaetsyadezorganizatsiya kardiomyocytov, čo vedie k zmene mehanicheskoymodeli myokardu, narušenie jeho čerpacie funkcie a srdcové zlyhanie.
Pokiaľ ide o mutáciu srdcového aktínu súdruh v roku 1998 publikoval článok T. Olson et al. [6] preukázaná štúdiami dvoch nezávislých semeys Autozomálna dominantné idiopatická kardiomyopatia (jeden semyanemetskogo pôvodu, druhý - švédsky-nórsky). Pre vsehchlenov vykonáva echokardiografia, biopsiyamiokarda, DCM identifikovať charakteristické znaky (fokálna interstitsialnyyfibroz a hypertrofia kardiomyocytov). Pre zistenie mutácií aktínu bola použitá PCR. dve jediné mutatsiietogo gén identifikovaný: jeden - v kardioaktina génu 5. exónov (nahrádzajúci guaninana adenín, čo vedie ku kódujúce syntézu histidínu v 312 mpolozhenii namiesto arginínu) a druhý - na 6. exónov (výmena adeninana guanín, čo objavil syntézu 361-polohe glutamín glitsinavmesto). Ale mohol by tieto zmeny považovať za vramkah kardioaktina polymorfizmus génu. Ak chcete vylúčiť také predpolozheniyaprotestirovany 435 nepríbuzných ľudí popísanú mutáciu nebol vyyavlenou je. Z tohto dôvodu sú tieto prevedenia assotsiiruyutsyaimenno aktinového génu s idiopatickou dilatačná kardiomyopatia.
Skutočnosť, že naša práca nemohli byť detekované mutatsiyagenov aktínu a dystrofín nie je priamym vyhlásenie, že mutácie nie. Možno, že mutácia sa vyskytuje vbolee neskorších štádiách choroby? Je potrebné poznamenať, že v nashemissledovanii nevykonáva genetickú analýzu v rodinách s idiopaticheskoyDKMP a nepríbuzných ľudí boli odobraté. Pravdepodobne glubokihvyvodov tiež potrebujú veľkú populáciu z hľadiska issledovanie.I nesmie byť menšia významné štúdie gény drugihstrukturnyh zložky srdcového svalu, najmä kollagenai elastínu mutácií, ktoré môžu mať tiež hodnotu v razvitiiHSN.

Referencie:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic genetickej aspekty chronickým srdcovým zlyhaním ivozmozhnosti korekcie drog. / Diss. ... Dr med. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M. R. Prečo myokardu zlyhanie? Vysvetlenie od základného výskumu. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H. Su J., Goytia V., Towbin J.A. Dôkaz pre dystrofín missensemutation ako príčina X-viazanú dilatačná kardiomyopatia. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F. Cau M., Gana A., Congiu R., Arved G. Mateddu A., Marrosu M. G., Cianchetti C, RealD G. Cao A., Melis M.A. Stručná správa: delécie dystrofínového svalov promoterregion spojené s X-viazanou dilatačná kardiomyopatia. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasín J., Muntoni F., Severín GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C, CameriniF., Falaschiho A., Mestroni L., Giacca M. a HMD Study Group , Nejaky_bod mutácie v 5'mieste zostrihu v géne pre dystrofín firstintron zodpovedný za X-viazaná rozšírený cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T. M., Michels za VVS, Thibodeau S. N., Tai Y.S., Keating M.T. Aktínu mutácie v dilatačná kardiomyopatia, dedičná forma srdcového zlyhania. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R. D., Maeda M., Roberds S. L., HOLDER., Bohlmeyer T. Young J. B., Campbell K.P. 5'dystrofín duplicationmutation spôsobuje nedostatok membránu alfa-dystroglykanu v afamily s X-viazanou kardiomyopatie. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W. M., Cremer M., Herrmann R., Grünig., Fogel W., Scheffold T., Goebel H. H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. a kol. X-viazaná dilatačná kardiomyopatia. Novel mutationof dystrofínového génu. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.