Polarizácia metódy fluorescenčné protilátky. korelácia imunoglobulínu

Riešiť otázku existencie nezávislého otáčania podjednotiek imunoglobulínov Veľkú pomoc bola metóda fluorescenčné polarizácie. Základný prístup, ktorý bol použitý v týchto pokusoch pre štúdium imunoglobulínov pružnosti spočívala v porovnaní experimentálne určeného časovej synchronizácie imunoglobulínových molekúl, ktorý sa nachádza v experimente charakterizujúce časový molekulu roviny polarizovaného svetla, s dobou korelácia vypočítané na základe predpokladu, že tuhosť molekuly.

Takže, ak budeme predpokladať, že molekula IgG tuhé elipsoid rotačnej osi s pomerom 1: 2 a molekulovej hmotnosti 150.000, doba korelácia molekuly musí byť rovný 73 ns, a experimentálne pozorované, že bola všeobecne oveľa nižšia: 20-40 ns. To ukazuje na schopnosť fragmentov na nezávislú relatívny pohyb, a teda aj pružné spojovacie častí polypeptidové reťazca. Podobná dáta bola získaná spin štítky.

Vytrvalec a Griffith (Stryer, Griffith, 1965) pre stanovenie časovej synchronizácie spin-značený haptén naviazaného na protilátku, štúdium správania hmoty, ktorý obsahuje ako skupinu fluorochrómy, spinové značku a odlišný viskóznych roztokov.

zmenou viskozity riešenie pridaním glycerolu, dosiahla svoj EPR spektra zodpovedá spektru spin-značené haptény viazané na aktívne miesto. Ďalej, spôsob fluorescenčné polarizácie je určená dobou korelácia. Tak bolo zistené, nájdené korelácie času N-O skupina spojená spin-značený haptén byť 12 ns. Autori správne na vedomie, že táto hodnota môže byť príliš nízka v porovnaní s koreláciou časového Fab-fragmentu, pretože nemožno vylúčiť možnosť otáčania kruhu vzhľadom imminoksilyyugo dinitrofenyl skupiny, pevne spojený s aktívnym centre. Táto nevýhoda je spoločná pre všetky pokusy pre stanovenie doby korelačný IgG Fab-fragmentu pomocou spin-značený haptén.

">

Hsia a Piette (Hsia, Piette, 1969) pre určenie časovej synchronizácie spojené s aktívnym centre spin-značený haptén, kalibračné závislosti na viskozite EPR spektra roztoku spin etikiet. Doba korelácia, zodpovedajúce konkrétnej rozsah, určené Stokesova zákona - Einstein, zvažuje, že účinná Stokesův polomer ochrannej známky je 5 A. Najkratšia spin-značený haptén najviac pevne viaže na aktívne miesto, mal čas korelácia 39 ns.

Dweck et al (Dwek e. a., 1975), vypočítaná doba korelácia spin-značeného DNP lokalizované v aktívnych centier IgA (MOPC 315) a FAB a Fv-fragmsntov. Bolo zistené, že 44,4, 23 a 6,5 ​​ns, v tomto poradí.

získané králičie protilátky priamo proti spin etikiet 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-amino (N-dichlortriazinu) slúžil imunizáciou s haptény. Výsledkom tvorby špecifických komplexov protilátky a peptickej fragmenty papannovyh s spin štítok má svoju silnú imobilizáciu. Miešanie príslušného množstva roztokov nešpecifické IgG a etikety podobných podmienok bolo len vo vzhľade EPR spektra voľného značenia. korelácia času Štítky vypočítané Shimshiku a McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). bolo zistené, že 32, 30 a 18 ns, respektíve pre komplexy spinovej značky s protilátkou, Fc- a Fab-fragmenty izoelektrického bodu (pH 6,3).
Získané hodnoty času korelácia IgG na Fab fragmentov a potvrdené v citovanom dokumente.

Rozdiely v čase korelácia, získaná pre Fab-fratmenta ako izolovaný a je súčasťou F (ab) 2 a intaktné protilátka označujú obmedzenie voľného otáčania Fab fragmentov, podjednotiek uložená reakcií F (ab) 2 a IgG. Zvýšenie teploty vedie k zníženiu zníženej štandardných podmienok (3 * 105 P / ° C), čas korelácia označí komplexy s F (ab) 2 a IgG.

Zdá sa, že pri zahrievaní sloboda Relatívne im v pohybe zvyšuje podjednotky. Možnosť získania protilátok na spinovej značku, slúžil imunizáciou s haptény je potvrdené v inej štúdii (Humphries, McConnell, 1976).