Základy molekulárnej terapia. génová terapia

Video: Molekulárna podstata individualizáciu terapie s častými mutáciami v NSCLC

Zriadenie umiestnenia a sekvencie génu, ktorého mutácie spôsobujú špecifické ochorenia, rovnako ako väčšina moderných metód mutácie a jeho testovanie môže diagnostikovať ochorenie v neo, a dokonca aj prenatálny vývoj organizmu. Vďaka tomu je možné zmierniť prejavy genetickým defektom o liečbe drogovej závislosti, strava, transfúzia krvi, atď

Avšak tento prístup nevedie k odstráneniu vady a, všeobecne, dedičné ochorenie, nemožno vyliečiť. Situácia je komplikovaná skutočnosťou, že mutácia jedného génu môže produkovať rôzne účinky na telo. V prípade, že mutácia spôsobuje zmenu aktivity enzýmu, pre ktorý kódov, môže to viesť k hromadeniu toxického substrátu, alebo alternatívne k deficitu zlúčeniny potrebné pre normálne fungovanie bunky.

Dobre známy príklad takejto choroby je fenylketonúria. Je spôsobená mutácií v géne pre pečeňového enzýmu fenilalanindegidroksilazy katalyzovať premenu fenylalanínu na tyrozín. Výsledkom je zvýšenie endogénna hladiny fenylalanínu v krvi, čo spôsobí nesprávnu tvorbu myelínové pošvy okolo axónov nervových buniek v centrálnom nervovom systéme a v dôsledku toho ťažkej mentálnej retardácie.

V prípade, že mutácia ovplyvňuje gén štrukturálne proteín, potom to môže viesť k vážnym poruchám na úrovni buniek, tkanív alebo orgánov. Príkladom takéhoto ochorenia je cystická fibróza.

Delécie v géne, ktorý kóduje proteín nazývaný cystická fibróza transportér vedie k syntéze defektného proteínu (nedostatok fenylalanínu 508) a poruchami transportu chloridových iónov cez bunkové membrány. Jedným z najviac škodlivých dôsledkov toho je, že hlien, ktorá lemuje a chráni pľúca, sa stáva mimoriadne silná. To komplikuje prístup do buniek pľúc a prispieva k akumulácii škodlivých mikroorganizmov. Bunky lemujúce dýchacích ciest v pľúcach, sú usmrtení a nahradená jazvy tkaniva (odtiaľ názov choroby). V dôsledku toho, že pacient umiera z respiračné zlyhanie.

Dedičné choroby sa líšia komplexné klinické príznaky a ich liečba traditsinnoe predovšetkým symptomatická: pre liečbu fenylketonúriou bezalaninovuyu predpísanú diétu, výmenu chybných funkčné proteíny, intravenózne podávanie, pre kompenzáciu stratené funkcií vykonávaných transplantáciu kostnej drene alebo iných orgánov. Všetky tieto opatrenia sú väčšinou neúčinný, nákladný a trvanlivý a málo pacientov prežije do staroby. Preto je vývoj nových liečebných postupov je veľmi naliehavá.

génová terapia

Génová terapia sa nazýva genetické inžinierstvo ľudských somatických buniek, zamerané na korekciu genetický defekt, ktorý spôsobuje ochorenie. Korekcia špecifických ochorení sa vykonáva zavedením do defektných buniek normálnych somatických exprimovaných génov. Pre 80-rokov. Ak nie sú vytvorené vyvinuté metódy na prípravu jednotlivých génov a eukaryotických expresných vektorov, sa stáva rutinnou prenos génov experimenty u myší genetickú korekcia perspektívne stanú skutočnosťou.

V roku 1990 v USA Dr. W. French Anderson (W. francúzsky Andrson) prvý pokus o génovej terapii pre liečbu ťažkú kombinovanú imunodeficienciou (SCID) na trojročnej dievčatá Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) boli vytvorené. Táto choroba je spôsobená mutáciou génu kódujúceho adenozanadenilazu (ADA). Nedostatok tohto enzýmu umožňuje hromadenie adenozín a deoxyadenozín krvi, toxický účinok, čo vedie k smrti B a T lymfocytov v periférnej krvi a v dôsledku imunodeficiencie.

Deti s týmto ochorením by mala byť chránená pred akýmkoľvek infekcií (obsiahnuté v špeciálnych sterilných komory), ako akékoľvek ochorenie môže byť fatálne. 4 roky po začatí liečby dieťa pozorovať expresiu normálne fungujúce ADA SCID a úľavu od príznakov, ktorý dovolil, aby odišla sterilné komory a žiť normálny život.

Tak bolo preukázané, v zásade možnosť úspešného génovej terapie somatických buniek. Od 90-tych rokov. testované množstvo génovej terapii genetických chorôb, medzi ktorými sú najťažšie, ako hemofília, AIDS, rôznych typov zhubných novotvarov, cystická fibróza a ďalšie. V súčasnej dobe liečiteľná pomocou transgeneze asi 10 ľudských ochorení.

Rôzne genetických chorôb vopred stanovené množstvo vývoja prístupy génovej terapie. Tak vyriešiť dva hlavné problémy: prostriedky pre dodávanie terapeutického gena- spôsob poskytnutia cielené podanie do buniek určených na nápravu. Doteraz sa všetky prístupy k génovú terapiu somatických buniek môžu byť rozdelené do dvoch kategórií: (obr. 3.15), ex vivo terapiu a in vivo.

Obr. 3.15. Schéma génovej terapie ex vivo (a) a in vivo (a)

ex vivo génová terapia zahŕňa korekciu genetický defekt buniek mimo telo a potom sa vracať normálne fungujúce bunky v tele.

v génovej terapii in vivo zahŕňa dodanie terapeutického génu priamo do buniek špecifické tkaniva pacienta. Zoberme si tieto postupy podrobnejšie.

ex vivo génová terapia zahŕňa nasledujúce kroky:
1) poskytnutie pacientovi deficitom buniek a ich kultiváciu;
2) prenos požadovaného génu do izolovaných buniek transfekcia terapeutického génového konštruktu;
3) výber a kapacita geneticky korigované bunky;
4), transplantácie alebo transfúzia týchto buniek do pacienta.

S použitím vlastné bunky pacienta je zaistené, že po svojom návrate sa nevyvinula imunitnú odpoveď. prenos postup génový konštrukt by mali byť účinné, ale normálny gén, by mala byť zachovaná stabilne a trvale exprimovat.

Spôsoby prenosu génov vytvorené povahy, sú vírusy. Aby sa dosiahlo efektívny prenos génov vektorov pre dve skupiny vírusov, sa používajú hlavne - (viď obr. 3.16), adenovírusy a retrovírusov. geneticky detoxikovať variantov vírusov používaných v génovej terapii.

Obr. 3.16. Vírusy použité pre vytvorenie terapeutických vektorov

Zoberme si zariadenie a využitie návrhov založených na retro-vírusy. Pripomeňme, že retrovirusove genóm obsahuje dva zhodné jednovláknové molekuly RNA, z ktorých každý sa skladá zo šiestich sekcií: dve dlhé terminálne repetície (LTR) na 5'a 3` končí nekódujúcej sekvenciu, * P + potrebné pre balenie RNA do vírusovej častice, a tri regióny, kódujúci štrukturálne proteín vnútornej kapsidy (gag), reverznej transkriptázy (pol) a obalový proteín (env) (obr. 3.17, a).

Obr. 3.17. Genetická mapa typického retrovírusu (a) a retrovirového vektora mapa (a)

Pripomeňme, že retrovírus životný cyklus zahŕňa nasledujúce kroky:
1. Infekcie cieľových buniek.
2. Syntéza DNA kópie genómu s natívnou reverznej transkriptázy.
3. Dopravný vírusovej DNA do jadra.
4. Integrácia vírusovej DNA do chromozómu hostiteľskej bunky.
5. Usporiadanie mRNA z vírusovej DNA pod kontrolou silného promotora lokalizovaného na 5'-LTR časti.
6. Broadcast proteíny Gag, Pol a Env.
7. tvorbe vírusovej kapsidy a balíček dvoma molekulami RNA reťazcov a reverznej transkriptázy.
8. Uvoľnenie viriónov z bunky.

Pri príprave retrovirového dĺžky vektora DNA retro vírusu vložená do plazmidu odstrániť väčšinu génu gag a úplne gény pol a env, a namiesto toho vložený "terapeutický" génu T a prípadne markerovou selektívne gén Rg so svojim vlastným promótorom (obr. 3,17, b ). T gén usporiadanie bude riadený rovnakým silného promotora lokalizovaného na 5'-LTR časti. Na tomto schéme základe poskytuje rôzne retrovirusove vektory, a maximálna veľkosť DNA inzertu o osem tisíc. Bp

Takto získaná štruktúra môže byť použitá sama o sebe pre transformáciu, ale jeho účinnosť a následnú integráciu do genómu hostiteľskej bunky, je veľmi nízka. Z tohto dôvodu, je obal technika celková RNA retrovirusove vektor, do neporušených vírusových častíc bola vyvinutá, ktorá s vysokou frekvenciou do bunky a prenikajú zaručené integrovaný do genómu hostiteľa. Pre tento takzvaný "pakuyuschaya" bunkové línie bola založená. Dve rôzne časti chromozómov buniek šité retrovirusove gény gag a pol-env, zbavené schopnosti zabaliť kvôli nedostatku konzistencie + (84 * +) (obr. 3.18).

Obr. 3.18. Schéma pre získanie baleného vírusového vektora

To znamená, že oba tieto fragmenty sú transkribovaných, ale zároveň zbavený RNA prázdnych kapsidy. Transfekcia RNA vírusového vektora v týchto bunkách je začlenený do chromozomálnej DNA a je transkribovaných pre vytvorenie plnej dĺžky RNA retrovírus, a za týchto podmienok balených v kapsidy iba RNA vektora (iba obsahuje sekvenciu +). Výsledné intaktné vírusové častice sa používajú pre účinné dodávanie retrovirového vektora do cieľovej bunky.

Retrovírusy infikujú iba aktívne sa deliace bunky značne. Na prenos ich gény sa spracuje s čistenými časticami balených retrovirového vektora alebo spoločne kultivované s bunkovou líniou ich výroby, a potom vykonať výber pre separáciu cieľových buniek a baliace bunke.

Transdukované bunky boli starostlivo kontrolované na úrovni syntézy génového produktu terapeutické, absencia príslušného retrovirusove replikácie, žiadna zmena v schopnosti buniek rásť a funkciu.

Zvlášť vhodné pre génovú terapiu, sú bunky kostnej drene. To je vzhľadom k prítomnosti totipotentné embryonálnych kmeňových buniek, ktoré môžu proliferovať a diferencovať do rôznych typov -B- bunky a T lymfocyty, makrofágy, erytrocytoch, trombocytoch a osteoklastov. Tieto bunky sa používajú na liečbu mnohých dedičných ochorení, medzi nimi sme už spomenuli ťažkú kombinovanú imunodeficienciou, Gaucherova choroba, kosáčikovitú anémiu, talasémia, osteoporóza a ďalšie.

Okrem totipotentných kmeňových buniek kostnej drene, ktoré sú ťažké izolovať a kultivovať použité pupovinnoy kmeňových buniek z krvi (dáva sa prednosť použitia génovej terapie pre dojčatá) a pečeňových buniek - hepatocytov - pre liečbu hypercholesterolémie.

V génovej terapii in vivo, že je obzvlášť dôležité zabezpečiť doručenie terapeutického génu do defektných buniek. Takéto cielené dodanie môžu poskytovať modifikované vektory, ktoré sú založené na vírusy, ktoré môžu infikovať určité bunkové typy. Zvážiť prístup vyvinutý pre liečbu už bolo spomenuté vyššie cystickou fibrózou. Vzhľadom k tomu, že pľúca sú otvorené dutiny, terapeutické gény dodať im je pomerne jednoduché. Klonovaná variant zdravého génu bola zavedená v inaktivovaného adenovírusu (obr. 3.19). Špecifickosť tohto typu vírusu je, že sa infikuje sliznicu pľúc, čo spôsobuje nádchu.

Obr. 3.19. Systém pre získanie vektora na báze adenovírusu

Navrhnuté tak, aby bol vírus testuje nástrekom do nosa a pľúc pokusných zvierat a potom sa ľudia-pacientmi. V niektorých prípadoch sa zavedenie a expresiu zdravého génu, a obnovenie normálneho transportu chloridových iónov. Možno, že tento prístup (zavedenie normálneho génu nosovým aerosólom) v blízkej budúcnosti bude široko používajú na liečbu príznakov cystickej fibrózy v pľúcach.

Okrem retro- a adenovírusov v génovej terapii pokusy o použití a ďalších typov vírusov, ako sú napríklad Herpes simplex vírusu. Znakom tohto dvojvláknové (152 tis. Bp) DNA vírus, je jeho schopnosť špecificky zasiahnuť neuróny. Existuje mnoho genetické ochorenia ovplyvňujúce centrálny a periférny nervový systém - nádory, metabolické poruchy, neurodegeneratívne ochorenia (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba).

Herpes simplex vírus typu I (HSV), vektor je veľmi vhodný pre liečenie takýchto ochorení. Kapsidy vírusu poistky s membráne neurónu, a jeho DNA je transportovaný do jadra. Je navrhnuté niekoľko spôsobov prenosu terapeutický gén pomocou HSV-vektorov a úspešne testované na experimentálnych zvieratách.

Vírusové vektory majú niekoľko nevýhod: vysoké náklady, obmedzenú kapacitu klonovaných a možných zápalových reakcií. Takže v roku 1999, ako výsledok, ktorý vyvinuli neobyčajne silná imunitná reakcia na adenovirový vektor bol zabitý 18-ročný dobrovoľník, ktorí sa zúčastnili testovania lieku. V roku 2002, dve deti vo Francúzsku v priebehu liečenia imunodeficiencie (zavedenie terapeutických génov do kmeňových buniek za použitia retrovírusov) vytvoril stav podobný leukémii.

Preto vyvinul nevírusové prenos génov systému. Najjednoduchšie a najmenej účinným spôsobom - to je injekcia plazmidovej DNA do tkaniva. Druhý prístup - je bombardovanie mikroprojektily tkaniny zlato (1-3 mikrónov), konjugovanej s DNA. Tak terapeutické gény sú exprimované v cieľových tkanivách a ich produktov - terapeutických proteínov - do krvného obehu. Hlavnou nevýhodou tohto prístupu je predčasné inaktiváciu alebo zničenie týchto proteínov s krvnými zložkami.

Zavedenie DNA môže byť vykonaná zabalením do umelého lipidovej membrány. Takto získané guľovité častice, lipozómy môžu ľahko preniknúť cez bunkovú membránu. Lipozómy vytvorený s rôznymi vlastnosťami, ale zatiaľ účinnosť tejto dodávky je nízky, pretože väčšina DNA bola podrobená lysozomálnej degradácii. Tiež syntetizované DNA konjugáty pre dodávanie genetického konštruktu do rôznych molekúl, ktoré sú schopné zaistiť jeho bezpečnosť, cielené dodanie a preniknutie do bunky.

V posledných rokoch, intenzívne pokusy vytvoriť umelý chromozóm 47, čo by umožnilo začleniť veľké množstvo genetického materiálu s úplnú sadu regulačných prvkov na jeden alebo viac terapeutických génov. To by bolo možné použiť genómovej verziu terapeutického génu, a tým zaistiť jeho stabilitu a účinné dlhodobú expresiu. Pokusy ukázali, že vytvorenie umelých ľudských chromozómov obsahujúcich terapeutické gény, je reálny, ale nie je jasné, ako taká obrovská molekula zavádza do cieľového bunkového jadra.

Hlavných problémov génovú terapiou, okrem rizika ťažkých imunitných reakcií, sú ťažké dlhodobé skladovanie a prevádzku terapeutickej DNA do tela pacienta, mnoho multigenních chorôb, čo je ťažké cieľ pre génovú terapiu, a riziká vyplývajúce z použitia vírusu ako vektora.

NA Warriors, TG Volová

Delež v družabnih omrežjih:

Podobno